"Bases moleculares que determinan la
especificidad de hospedero de
Salmonella typhi"
Carlos A. Santiviago C.
Pontificia Universidad Católica de Chile
Programa de Doctorado en Ciencias
Mención Genética Molecular y Microbiología
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Introducción

El género Salmonella comprende más de 2.200 serovares distintos que causan una variedad de enfermedades, tales como gastroenteritis, bacteremia y fiebre entérica (tifoidea y paratifoidea). Algunos serovares pueden infectar un amplio rango de hospedero. Un ejemplo de esta aparente inespecificidad se observa en S. enteritidis, que es capaz de infectar un gran número de aves y mamíferos, incluyendo al hombre. En cambio, otros serovares son altamente adaptados a un hospedero específico, como es el caso de S. gallinarum que infecta sólo a aves de corral, S. choleraesuis que infecta porcinos, S. dublin que infecta bovinos, S. typhimurium que produce fiebre entérica al ratón y finalmente, S. typhi que infecta exclusivamente al ser humano (Collins, 1974; Barrow y Duchet-Suchaux, 1997). El resto de los serotipos de Salmonella no produce enfermedad sistémica en el hombre ni en animales adultos inmunológicamente competentes.

S. typhi es una enterobacteria Gram negativa, reconocida como agente etiológico de la fiebre tifoidea en humanos (Selander y cols., 1990). La fiebre tifoidea es una enfermedad del sistema retículo-endotelial, caracterizada por una fiebre alta, que puede causar la muerte del hospedero cuando no es tratada oportunamente. Aunque la incidencia de esta enfermedad tiende a disminuir a nivel mundial, sigue constituyendo un problema de salud pública en Chile y en otros países en vías de desarrollo. La OMS ha estimado que existen 16,6 millones de casos anuales de fiebre tifoidea en el mundo, con un total aproximado de 600.000 muertes (Pang y cols., 1995; Pang y cols., 1997), lo que hace imprescindible implementar nuevas estrategias de prevención y control de la enfermedad. Estas estrategias deben estar dirigidas a mejorar las condiciones sanitarias, el tratamiento de las aguas y, por otra parte, a incentivar el desarrollo de vacunas que presenten mayor eficacia que las usadas hasta ahora (Dougan y cols., 1987; Pang y cols., 1995; Pang y cols., 1997). Por esta razón, se hace necesario estudiar las bases moleculares de los mecanismos de patogenicidad de S. typhi, cuya comprensión permitirá abordar un importante problema de salud pública desde nuevas perspectivas.

Aún cuando el ciclo infectivo de Salmonella parece bien caracterizado a nivel fisiológico (Slauch y cols., 1997), los mecanismos moleculares de este proceso recién comienzan a ser entendidos. Se ha establecido que S. typhi inicia su ciclo infectivo en el hombre al ser ingerida en alimentos y aguas contaminadas. Luego de sobrevivir a los mecanismos de defensa presentes en el tracto digestivo, la bacteria atraviesa las células epiteliales del intestino delgado a nivel del íleo, para llegar al tejido linfoide subyacente. Desde aquí, las bacterias son fagocitadas y transportadas por macrófagos hacia los nódulos linfáticos mesentéricos, donde se multiplican y se diseminan al torrente sanguíneo, desencadenando así la fiebre tifoidea (Finlay y Falkow, 1989). Debido a la capacidad de sobrevivir intracelularmente en los macrófagos humanos, S. typhi ha sido clasificada como un patógeno intracelular facultativo (Groisman y Saier, 1990; Chatfield y cols., 1992). Una última fase del ciclo infectivo se llevaría a cabo sólo en algunos individuos y consiste en el asentamiento de la bacteria en la vesícula biliar, conduciendo finalmente al estado de portador crónico.

Debido a que S. typhi tiene al ser humano como único hospedero, ha sido difícil estudiar sus mecanismos de patogenicidad (Chatfield y cols., 1992). La mayor parte del conocimiento respecto a la interacción de este patógeno con su hospedero se basa en los resultados obtenidos a partir de ensayos in vitro usando líneas celulares y en los resultados obtenidos del modelo de laboratorio S. typhimurium-ratón. Mediante el uso de estas técnicas se ha podido demostrar una relación directa entre la virulencia in vivo de la bacteria, con la capacidad de invadir células epiteliales y sobrevivir en macrófagos in vitro, validando de esta forma la importancia de estos eventos en la patogenicidad de la bacteria (Galán y Curtiss, 1989; Bäumler y cols., 1994; Penheiter y cols., 1997). Por otro lado, el estudio de mutantes defectuosas en estos procesos, ha permitido descifrar poco a poco los mecanismos por los cuales la bacteria logra acceder al interior del hospedero y sobrevivir en él.
Bases moleculares de la virulencia en el género Salmonella

En los últimos diez años se ha descubierto y caracterizado un gran número de genes de Salmonella involucrados, directa o indirectamente, en los procesos de entrada de la bacteria a células epiteliales y de sobrevivencia en el interior de los macrófagos del hospedero. La mayoría de los genes identificados se encuentran agrupados en zonas específicas del cromosoma bacteriano, denominadas "islas de patogenicidad". Gran cantidad de evidencia experimental sugiere que estas regiones han sido adquiridas mediante transferencia horizontal de material genético (Hacker y cols., 1997). Actualmente, se conocen cinco islas de patogenicidad en representantes del género Salmonella (SPI), algunas de las cuales se encuentran presentes en cepas virulentas y ausentes en cepas no virulentas. Es importante mencionar que la relativa facilidad que presenta el trabajo genético con cepas de S. typhimurium ha permitido un rápido avance en el estudio de las relaciones estructurales y funcionales que presentan estas islas de patogenicidad.

La mayoría de los genes involucrados en el proceso de invasión a células epiteliales se encuentran agrupados en la isla de patogenicidad 1 (SPI 1), ubicada en el minuto 63 del cromosoma de S. typhimurium (Galán, 1996). Gran parte de los genes presentes en SPI 1 codifican proteínas estructurales y regulatorias de un nuevo sistema de secreción de proteínas, denominado "tipo III" (Galán, 1996; Hueck, 1998). Este aparato de secreción permite exportar algunas proteínas, codificadas también en este locus, a la superficie bacteriana de S. typhimurium. Por otra parte, se ha observado que este sistema de secreción permite la translocación de proteínas "efectoras" directamente al citoplasma de células epiteliales (Collazo y cols., 1995; Wood y cols., 1996; Collazo y Galán, 1997). El análisis de secuencia de los genes estructurales del sistema de secreción indica que éstos se encuentran presentes en otros enteropatógenos (Shigella y Yersinia) y también en fitopatógenos (P. solanacearum y X. campestris). Además, estos genes presentan homología con los genes involucrados en el ensamblaje del flagelo en E. coli (Van Gijsegem y cols., 1993; Hueck, 1998).

Una segunda isla de patogenicidad (SPI 2), ubicada en el minuto 31 del cromosoma de S. typhimurium, fue descubierta mediante selección de mutantes incapaces de sobrevivir en ratones (Hensel y cols., 1995; Shea y cols., 1996; Ochman y cols., 1996). El análisis de secuencia de los genes presentes en este locus indicó que codifican para un segundo aparato secretor tipo III, cuya expresión sería requerida para la sobrevivencia de la bacteria dentro de los macrófagos del hospedero (Shea y cols., 1996; Ochman y cols., 1996). Otro locus asociado a la virulencia de Salmonella (SPI 3) ha sido descrito en el minuto 82 del cromosoma de S. typhimurium y contiene genes esenciales para la sobrevivencia bacteriana en macrófagos (Blanc-Potard y Groisman, 1997; Blanc-Potard y cols., 1999). Cercano al minuto 92 del cromosoma de S. typhimurium se ha reportado la presencia de una cuarta isla de patogenicidad (SPI 4) (Wong y cols., 1998) y, más recientemente, se ha caracterizado una quinta isla (SPI 5), cuyos genes codificarían proteínas requeridas para la enteropatogenicidad de Salmonella, pero no para la capacidad de producir una infección sistémica (Wood y cols., 1998). Hasta el momento, tres de estas islas de patogenicidad (SPI 1, SPI 2 y SPI 4) han sido descritas en cepas de S. typhi (Ochman y Groisman, 1996; Wong y cols., 1998).
La especificidad de hospedero, un puzzle sin resolver

A pesar del rápido progreso en la identificación de algunos de los elementos clave en la virulencia de Salmonella mediante el uso del modelo de tifoidea murina, nuestro conocimiento acerca de los genes y mecanismos envueltos en la expresión de la especificidad de hospedero es muy limitado. Estudios acerca de la distribución de islas de patogenicidad y operones requeridos para la biosíntesis de fimbrias y cápsula en distintos serotipos de Salmonella sugieren que, durante la evolución, nuevas combinaciones de determinantes de virulencia surgieron a través de múltiples eventos de transferencia horizontal de genes. Este proceso evolutivo podría haber conducido al desarrollo de la adaptación a un hospedero único (Baümler y cols., 1998). Sin embargo, la adaptación a un hospedero específico no puede ser explicada únicamente por la adquisición de islas de patogenicidad como SPI 1 y SPI 2, ya que estos determinantes de virulencia se encuentran presentes en todas las subespecies de S. enterica estudiadas. Así, en el desarrollo de una especificidad de hospedero podría estar envuelta la coordinación de ciertos factores que le permitan al patógeno usar todo su arsenal de virulencia en el contexto de un hospedero determinado (Bäumler, 1997).

Fuera del género Salmonella, recientemente se ha relacionado la pérdida de material genético con la expresión de ciertos factores de virulencia. La mayoría de las cepas de E. coli producen la actividad lisina descarboxilasa (LDC), codificada en el gen cadA. Esta actividad no está presente en Shigella, ya que dicha bacteria carece de una región importante de material genético que incluye al gen cadA. Sorprendentemente, cuando se introdujo el gen cadA de E. coli en cepas de Shigella, disminuyó considerablemente la virulencia y la actividad de la enterotoxina producida por el patógeno (Maurelli y cols., 1998). Los resultados de este trabajo sugieren fuertemente que la aparición de deleciones cromosomales específicas ("black holes") representa un mecanismo que contribuye, junto con adquisición de genes, a la evolución de la patogenicidad en algunas bacterias.

En forma similar, el proceso de adaptación a un nuevo hospedero podría estar determinado por la adquisición de nuevos determinantes de virulencia y también por la pérdida de ciertos genes o de sus funciones. Un ejemplo destacable de este proceso de adaptación se observa en S. gallinarum y S. pullorum, ambos miembros del mismo serotipo de Salmonella, que presentan una marcada especificidad de hospedero por aves acuáticas y de corral. Se ha especulado que su linaje evolucionó a partir de un ancestro muy similar a la actual S. enteritidis, que presentaba un amplio rango de hospedero. El proceso de divergencia a partir del ancestro común condujo a que S. gallinarum y S. pullorum perdieran la capacidad de expresar el flagelo (y por lo tanto su motilidad) y de mediar hemaglutinación sensible a manosa (MSHA) como consecuencia de la adquisición de ciertas mutaciones puntuales. Notablemente, cepas de S. enteritidis y S. typhimurium capaces de enfermar aves frecuentemente son incapaces de mediar MSHA y han perdido su motilidad. Estas observaciones han llevado a postular que la selección de mutaciones puntuales en los genes requeridos para la biosíntesis del flagelo y fimbrias de tipo 1, que ocurrieron durante la adaptación de Salmonella a hospederos avícolas, pueden dar cuenta en parte de la pérdida de virulencia de S. gallinarum/pullorum en ratones (Bäumler y cols., 1998).

Al igual que S. typhimurium, S. typhi es capaz de penetrar el epitelio intestinal del ratón (Pascopella y cols., 1995). Por su parte, S. typhimurium y S. typhi son capaces de penetrar células epiteliales humanas in vitro (Mills y Finlay, 1994), sugiriendo que ambos serovares utilizan mecanismos similares de invasión y "tráfico intracelular" en el epitelio intestinal y que este proceso no sería clave en la definición de la especificidad de hospedero que presentan ambas bacterias. Ya que los macrófagos de distintas especies animales podrían diferir en su capacidad de neutralizar un serotipo particular de Salmonella, la adaptación a un nuevo hospedero requeriría de una adaptación a sus fagocitos mononucleares. Con esta hipótesis en mente se ha podido establecer que S. typhi es capaz de sobrevivir en macrófagos de origen humano, pero no en macrófagos de origen murino. De manera recíproca, S. typhimurium es capaz de sobrevivir en macrófagos de origen murino, pero es incapaz de hacerlo en macrófagos de origen humano (Vladoianu y cols., 1990). En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la habilidad de los distintos serotipos de Salmonella para causar una enfermedad sistémica se relaciona de forma directa con su capacidad de resistir la acción bactericida de los macrófagos de un hospedero determinado. De esta forma, los fagocitos mononucleares comprenderían una barrera importante, si no la principal, capaz de restringir el rango de hospedero de los distintos serotipos de Salmonella.

En años recientes ha sido reportado que la invasión de Salmonella a macrófagos in vitro causa que una importante población de estas células hospederas entren en apoptosis (Monack y cols., 1996; Chen y cols., 1996; Lindgren y cols., 1996). La citotoxicidad producida en los macrófagos es estrictamente dependiente de la expresión de los genes presentes en la SPI 1 (Chen y cols., 1996; Lundberg y cols., 1999). Estas observaciones han permitido postular que la capacidad de inducir la muerte de los macrófagos infectados es un mecanismo esencial de virulencia para S. typhimurium (Lindgren y cols., 1996). Como se ha discutido, las características del proceso infeccioso producido por Salmonella sugieren que la capacidad de sobrevivir en los macrófagos, más que la capacidad de matarlos, es el mecanismo más coherente para explicar la etiología de las fiebres entéricas. De hecho, si la citotoxicidad producida en los macrófagos fuese esencial para la infección sistémica, uno esperaría que cepas con mutaciones en genes de la SPI 1 fueran atenuadas al ser inoculadas en ratones por vía intraperitoneal. Contrariamente, estas mutantes han demostrado ser totalmente virulentas al realizar este tipo de ensayos (Groisman y Ochman, 1997).
Factores del hospedero que afectan la susceptibilidad
a ser infectado por Salmonella


No todas las cepas de ratón son igualmente susceptibles a ser infectadas por S. typhimurium. Actualmente se conocen varios loci que afectan la capacidad del ratón para resistir infecciones sistémicas causadas por S. typhimurium y otros patógenos invasivos. Uno de estos loci corresponde a ity. Ha sido descrito que ratones con mutaciones en este locus (ItyS) poseen una baja población de macrófagos y células polimorfonucleares activadas, que los hace susceptibles a ser infectados por S. typhimurium, mientras que los animales ItyR presentan resistencia a la infección (Salyers y Whitt, 1994). Los fenotipos de resistencia y susceptibilidad a la infección asociados al locus ity son expresados a nivel de los macrófagos peritoneales y esplénicos del ratón (Lissner y cols., 1983; Salyers y Whitt, 1994). Otro locus importante es lps, cuya mutación afecta a una variedad de tipos celulares, como linfocitos B y T, macrófagos y fibroblastos. Ratones con mutaciones en lps no producen citoquinas cuando son inyectados con LPS (Salyers y Whitt, 1994). Un tercer locus importante es xid, cuya mutación genera animales con linfocitos B alterados, que producen anticuerpos (IgG e IgM) más lentamente que linfocitos de ratones normales (Salyers y Whitt, 1994). Es importante destacar que todos los loci involucrados con la susceptibilidad de un hospedero animal a sufrir infecciones causadas por patógenos invasivos corresponden a factores que, de alguna forma u otra, modulan la actividad y agresividad del sistema inmune, preferentemente a nivel de sus macrófagos.

Recientemente, se ha establecido una importante diferencia entre los mecanismos de invasión usados por S. typhi y S. typhimurium. S. typhi utiliza al CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) como receptor para entrar en células del epitelio intestinal humano, mientras que S. typhimurium no lo usa (Pier y cols., 1998). Esta marcada diferencia podría estar relacionada con los diferentes rangos de hospedero y los síntomas de la enfermedad causada por ambos patógenos. Interesantemente, éste es uno de los pocos trabajos en que se relaciona la invasión del epitelio intestinal con la especificidad de hospedero de distintos serovares de Salmonella.
El fenómeno de "avirulencia" y la respuesta hipersensible

Como es sabido, durante la evolución los animales han desarrollado una variedad de mecanismos para la detección y el control de las infecciones microbianas. Algunos de estos mecanismos no requieren de un encuentro previo con el patógeno y son altamente inespecíficos. También existen otros mecanismos que requieren de un encuentro previo con el patógeno y tienden a ser extremadamente específicos. Sorprendentemente, la posible existencia de un mecanismo que permita el reconocimiento de ciertos patógenos comunes en forma específica por un hospedero mamífero "naive" no ha sido estudiada en profundidad (Galán, 1998).

Este mecanismo ha sido ampliamente descrito en plantas, las cuales carecen de un sistema inmune adaptativo y han evolucionado estrategias para reconocer y eliminar en forma específica ciertos patógenos microbianos, montando una respuesta de defensa localizada conocida como la "respuesta hipersensible". Esta respuesta es caracterizada por una destrucción localizada del tejido en el sitio de la infección (necrosis local), la que restringe severamente la diseminación sistémica del patógeno en el organismo vegetal (Van den Ackerveken y Bonas, 1997; Bonas y Van den Ackerveken, 1997; Galán, 1998). La respuesta hipersensible es acompañada por otras respuestas de la planta, entre las que se incluyen un estallido oxidativo, la acumulación de moléculas mensajeras intracelulares, como el ácido salicílico, y la activación transcripcional de genes que codifican proteínas relacionadas con la defensa ante una agresión mediada por patógenos (PR) (Parker y Coleman, 1997). Este conjunto de respuestas anexas a la respuesta hipersensible es conocida como la "respuesta sistémica adquirida" (SAR).

La especificidad de hospedero en enfermedades bacterianas ha sido extensamente estudiada en fitopatógenos de los géneros Pseudomonas y Xanthomonas. El estrecho rango de hospedero que presentan estos patógenos resulta de la habilidad, que posee la mayoría de las plantas (las llamadas "no hospederas"), de reconocer a la bacteria en etapas tempranas del proceso infectivo y de montar una batería de respuestas de defensa. Hoy sabemos que las bases genéticas del proceso de resistencia están determinadas por la presencia de los llamados "genes de resistencia" (R), presentes en el hospedero, y de los correspondientes "genes de avirulencia" (avr), presentes en el patógeno (Van den Ackerveken y Bonas, 1997). De esta forma, la respuesta de defensa existe como una consecuencia de la interacción específica entre el producto de un gen R y el producto de un gen avr, tal como propuso Flor cuando enunció su famosa hipótesis del reconocimiento "gen por gen" (Flor, 1971; Leach y White 1996).
¿Avirulencia en Salmonella?

Estudios recientes han establecido que la mayoría de los factores de "avirulencia" de fitopatógenos son "presentados" al hospedero mediante sistemas de secreción de proteínas de tipo III, cuyos componentes se encuentran muy conservados en patógenos animales (Van Gijsegem y cols., 1993; Hueck 1998). Estas observaciones permiten inferir que algún patógeno animal que posea dicho sistema de secreción podría utilizarlo para introducir "equivalentes funcionales" de determinantes de avirulencia en su hospedero.

Esta novedosa hipótesis se ha visto respaldada por la aparición de un trabajo que describe la identificación y caracterización de una proteína de S. typhimurium llamada AvrA, que es secretada y translocada al interior de células eucariontes por medio del sistema de secreción tipo III codificado en la isla de patogenicidad SPI1 (Hardt y Galán, 1997). De hecho, el gen que codifica para esta proteína (avrA) también se localiza en esta isla de patogenicidad. AvrA comparte una gran similitud a nivel de secuencia aminoacídica con YopJ, proteína secretada por Yersinia spp., y AvrRxv, proteína de avirulencia secretada por Xanthomonas campestris. Notablemente, AvrA y YopJ comparten otras características comunes a los genes de avirulencia. Aparte de ser secretadas por un sistema de tipo III, su inactivación no conduce a la pérdida de virulencia y, al menos en el caso de AvrA, el gen que la codifica está presente en un grupo discreto de representantes dentro de su especie (Hardt y Galán, 1997; Galán, 1998). El asunto se vuelve más atractivo si notamos que S. typhi carece del gen avrA. En conjunto, estos interesantes resultados sugieren la posible existencia de mecanismos comunes entre enterobacterias y fitopatógenos en relación a la definición de hospederos específicos dentro del género Salmonella y, más específicamente, en relación a la definición del ser humano como hospedero de S. typhi.
Conclusiones y Perspectivas

A las puertas del siglo XXI, enfermedades infecciosas como la fiebre tifoidea continúan representando un problema de salud pública en los países en vías de desarrollo. Esto hace imprescindible implementar estrategias de prevención y control de la enfermedad, así como estrategias que apunten al mejoramiento de las condiciones sanitarias de la población.

A pesar de la activa investigación realizada en los últimos años, aún no se dispone de una vacuna segura y eficaz para el control de la fiebre tifoidea. Esto se debe, en gran medida, a una falta de conocimiento básico sobre los mecanismos de virulencia de S. typhi. El lento progreso en la adquisición de este conocimiento se debe parcialmente al hecho que S. typhi es un patógeno exclusivo del ser humano.

A la luz de los hechos, se hace imperativo estudiar los mecanismos moleculares que rigen la patogenicidad de S. typhi. Los conocimientos obtenidos a partir de dichos estudios no solo conducirán al desarrollo de estrategias racionales dirigidas al control eficaz del patógeno, sino que también permitirán comprender aspectos relevantes de la relación patógeno-hospedero que, eventualmente, serán utilizados en el diseño de nuevas vacunas e incluso en el desarrollo de nuevos fármacos antibióticos. Por otra parte, el conocimiento generado también permitirá adentrarnos en los mecanismos que gobiernan la interacción entre bacterias y células eucariontes, así como en procesos básicos de la fisiología celular tales como el ensamblaje y organización del citoesqueleto y la dinámica de transducción de señales provenientes del medio intra y extracelular.
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