Patogenicidad de Salmonella typhi"
Programa de Microbiología
Instituto de Ciencias Biomédicas
Universidad de Chile
El género Salmonella comprende más de 2.200 serovares distintos, algunos de los cuales pueden infectar un amplio rango de hospedero. S. enteritidis, por ejemplo, es capaz de infectar un gran número de aves y mamíferos, incluyendo el hombre, causando una variedad de síntomas dependiendo del hospedero. Otros, en cambio, son altamente adaptados a un hospedero específico, como es el caso de S. gallinarum que infecta sólo a aves, o S. typhi, que es el único serovar conocido que infecta exclusivamente al hombre, produciendo la fiebre tifoidea (Collins, 1974).
Aún cuando la incidencia de la fiebre tifoidea tiende a disminuir, se ha estimado que anualmente se presentan 16,6 millones de casos de fiebre tifoidea, y aproximadamente 600.000 muertes en el mundo (Pang y col., 1995). Conociendo la real dimensión del problema de salud pública que representa esta enfermedad, en general, en los países en vías de desarrollo, se hace imprescindible implementar nuevas estrategias de prevención y control. Estas estrategias deben estar dirigidas a mejorar las condiciones sanitarias y tratamientos de agua y por otra parte a desarrollar vacunas con mayor eficacia que las diseñadas hasta ahora (Dougan y col., 1987; Pang y col., 1995). Por esta razón, es necesario estudiar las bases moleculares de los mecanismos de patogenicidad de S. typhi, cuya comprensión permitirá abordar el problema desde nuevas perspectivas.
S. typhi inicia su ciclo infectivo en el hombre al ser ingerida en alimentos y aguas contaminadas. Luego de sobrevivir a los mecanismos de defensa presentes en el tracto digestivo, la bacteria atraviesa la barrera intestinal a nivel del íleo, para llegar al tejido linfoide subyacente. Desde allí las bacterias son fagocitadas y transportadas dentro de los macrófagos hacia los nódulos linfáticos mesentéricos, donde se multiplican y se diseminan al torrente sanguíneo, desencadenando así la fiebre tifoidea. Una última fase del ciclo se llevaría cabo sólo en algunos individuos y consiste en el asentamiento de la bacteria en órganos como la vesícula biliar, lo cual conduce al estado de portador crónico (Takeuchi, 1967; Finlay y Falkow, 1989)
Aún cuando el ciclo infectivo de Salmonella parece bien caracterizado a nivel fisiológico (Takeuchi, 1967; Francis y col., 1992), no se conocen en detalle los mecanismos moleculares de este proceso. Entre las etapas claves del ciclo infectivo de S. typhi y de otras Salmonellas, destacan la invasión de células epiteliales y la sobrevivencia dentro de macrófagos, que le permite a la bacteria diseminarse en el sistema retículoendotelial y permanecer en él.
La mayor parte de la información en relación a los mecanismos de invasión a células epiteliales y sobrevivencia en macrófagos murinos, ha sido derivada de ensayos en cultivos celulares. En el modelo de S. typhimurium-ratón se ha podido demostrar una relación directa entre la virulencia de la bacteria in vivo, con la capacidad de invadir células epiteliales y sobrevivir en macrófagos in vitro, validando de esta forma la importancia de estos eventos en la patogenicidad de la bacteria (Galán y Curtiss, 1989; Bäumler y col., 1994; Penheiter y col., 1997). El estudio de mutantes defectuosas en estos procesos, ha permitido descifrar poco a poco los mecanismos por los cuales la bacteria logra acceder al interior del hospedero y sobrevivir en él.
S. typhimurium atraviesa la barrera epitelial del intestino de ratón, desde la superficie apical hacia el tejido subyacente, induciendo importantes cambios morfológicos en el epitelio. Entre ellos se destaca la desaparición de las microvellosidades en los puntos de contacto entre la bacteria y la célula eucariótica (Clark y col., 1994; Jones y col., 1994; Penheitter y col., 1997). Cambios similares se han registrado in vitro. El contacto de la bacteria con la célula eucariótica es capaz de inducir reordenamientos del citoesqueleto de la célula debido a polimerización de micro-filamentos de actina, que conducen a movimientos ondulatorios denominados "ruffling" y permiten finalmente englobar a la bacteria en vacuolas (Francis y col., 1992; 1993). Estos eventos son acompañados además por aumento de la concentración intracelular de Ca2+ y una captación masiva de fluído extracelular o macropinocitosis. (Pace y col., 1993; García del Portillo y Finlay, 1994). Cada una de estas etapas es esencial para que la bacteria sea internalizada; de hecho, mutantes de S. typhimurium defectuosas en invasión fueron incapaces de inducir estos cambios en células epiteliales (Ginocchio y col., 1992; Ginocchio y col., 1994; García del Portillo y Finlay, 1994). La célula epitelial cumple un rol activo en este proceso, ya que la interacción de la bacteria con la célula a 4ºC no culmina con la invasión de la bacteria, solo es posible detectar adherencia a la célula. Además, al inhibir la polimerización de actina, usando citocalasinas, es posible bloquear la internalización de la bacteria (Finlay y Falkow, 1988).
Estudios del fenotipo invasor de S. typhi a células epiteliales han mostrado que, en líneas generales, este proceso es similar al caracterizado en S. typhimurium y otras enterobacterias. Se destaca la capacidad de inducir "ruffling" en la célula epitelial, la inhibición de la entrada de la bacteria a la célula por acción de citocalasinas, la cinética de entrada, aún cuando la eficiencia de la invasión es menor para S. typhi (Yabuuchi y col., 1986; Mroczenski-Wildey y col., 1989; Mills y Finlay, 1994; Leclerc y col., 1998).
S. typhi también es capaz de invadir células M in vitro (Kohbata y col., 1986). Las células M son células epiteliales especializadas (membranosas), que participan en la transferencia de antígenos desde el lumen intestinal a los folículos linfoides a los cuales están asociadas. Representan alrededor del 10% del total de células presentes en las placas de Peyer (Owen y Jones, 1974). En el modelo de segmentos de íleo de ratón ligado, se ha visto que S. typhi y S. typhimurium son capaces de asociarse preferen-cialmente a las células M, pero sólo S. typhimurium sería capaz de destruir estas células y producir un daño importante en el epitelio; S. typhi produciría un daño menor en las células M sin alterar los enterocitos de la capa epitelial (Kohbata y col., 1986; Clark y col., 1994; Jones y col., 1994; Pascopella y col., 1995; Penheitter y col., 1997).
No obstante la similitud de proceso global, persisten diferencias entre S. typhi y S. typhimurium en los mecanismos de infección. Se ha demostrado in vitro que la presencia del lipopolisacárido (LPS) intacto es necesaria para que S. typhi pueda ser internalizada por células HeLa (Mroczenski-Wildey y col., 1989). Sin embargo, se ha probado que mutantes rugosas (con LPS defectivo) son tan virulentas como la cepa silvestre y son capaces de producir la enfermedad en humanos (Hone y col., 1988). En cambio, en S. typhimurium se ha observado que mutantes rugosas por defectos en el gen galE, que codifica para una enzima involucrada en la síntesis del LPS, son atenuadas cuando son inoculadas en ratón o en ternero (Clarke y Gyles, 1986; Hone y col., 1987).
Usando mutantes por inserción de Tn5 se ha demostrado que la motilidad de la bacteria afecta el fenotipo invasor en S.typhi, pero no en S. typhimurium (Liu y col., 1988). Por otro lado, S. typhimurium requiere la presencia de un plasmidio para expresar su potencial virulento, elemento que no está presente en S. typhi (Roudier y col., 1990). El perfil de regulación de algunos factores de virulencia dependientes de PhoP/PhoQ aparece diferente entre ambas Salmonellas, (Baker y col., 1997), lo cual sugiere respuestas adaptativas distintas frente a los mismos estímulos. Uno de los hallazgos más recientes indican que S. typhi carece de uno de los genes codificados dentro de la isla de patogenicidad de Salmonella, SPI 1, denominado avrA por la homología que presenta con genes de avirulencia de fitopatógenos (Hardt y Galán, 1997). Este interesante resultado sugiere la posibilidad que existan mecanismos comunes entre enterobacterias y fitopatógenos en relación a la especificidad de hospedero, mecanismo que aún se desconoce para S. typhi.
La tendencia general de los primeros estudios de la genética de los procesos de invasión y proliferación intracelular de patógenos entéricos y especialmente de Salmonella, se basaron en el clonamiento de genes capaces de conferir la capacidad invasora a una cepa de E. coli no invasora. Esta estrategia fue muy efectiva para Yersinia pseudotuberculosis, ya que se clonó el locus inv, cuyo producto génico fue, por sí sólo, capaz de conferir el fenotipo invasor a una cepa de E. coli no invasora (Isberg y Falkow, 1985). En Yersinia enterocolitica se descubrió un segundo locus denominado ail, que codifica para una proteína de la membrana externa. Esta proteína, en conjunto con la proteína Inv, serían responsables de conferir el fenotipo invasor a Yersinia enterocolitica (Miller y Falkow, 1988).
Para S. typhi en cambio, esta estrategia no resultó exitosa, ya que sólo se logró transferir parcialmente el fenotipo invasor a E. coli. Elsinghort y colaboradores aislaron clones de E. coli que invadieron células epiteliales entre un 4 a un 7% respecto a lo observado para S. typhi (Elsinghort y col., 1989). Esto sugiere que la expresión de este fenotipo en Salmonella es multifactorial. En este trabajo, se caracterizaron los plasmidios que conferían el fenotipo invasor y se logró identificar un locus denominado inv. Éste también estaba presente en S. typhimurium, pero al ser transferido a E. coli no logró modificar el fenotipo no invasor de la cepa.
Los primeros estudios genéticos del proceso de invasión en S. typhimurium consistieron en clonar genes provenientes de una cepa virulenta que complementaran a una cepa no virulenta para el ratón; de esta forma se logró ubicar un locus distinto al descrito para S. typhi, que también se llamó inv (Galán y Curtiss, 1989).
Otra estrategia ampliamente utilizada para comprender la genética del fenotipo invasor, ha sido la caracterización de mutantes que carezcan de esta propiedad, obtenidas por inserción de transposones como Tn10, TnphoA, y derivados de Mu, que inactivan el gen en el cual se insertan. Galán y colaboradores utilizaron esta estrategia para caracterizar el locus inv de S. typhimurium. Ellos demostraron que este locus, compuesto de al menos 13 genes, está presente en la mayoría de los serotipos de Salmonella, incluyendo S. typhi (Galán y Curtiss III, 1991; Galán, 1996). Más aún, obtuvieron mutantes en distintos genes inv que presentaron defectos en la capacidad de invadir células epiteliales en cultivo, indicando que estos genes están involucrados funcionalmente en el fenotipo invasor. Demostraron además que mutantes inv de S. typhimurium son menos virulentas que la cepa silvestre en ratones cuando son inoculadas oralmente, aumentando la dosis letal cincuenta (LD50) en 2 a 3 órdenes de magnitud (Galán y Curtiss , 1991). Cabe destacar, sin embargo, que estas mutantes son igualmente virulentas que la cepa silvestre cuando son administradas por vía intraperitoneal (Galán y col., 1992). En S. typhimurium ya se han caracterizado seis loci distintos implicados en el fenotipo invasor (Betts y Finlay, 1992). Un estudio similar indicó que en S. enteritidis existen al menos nueve loci distintos, de los cuales uno corresponde al locus inv descrito para S. typhimurium (Stone y col., 1992). Estos resultados sugieren la gran complejidad del proceso de invasión o entrada a las células eucarióticas en Salmonella.
También se han obtenido mutantes de S. typhi defectivas en invasión (Hermant y col., 1995; Leclerc y col., 1998). La mayoría de las mutantes aisladas en estos trabajos coincidieron en el aislamiento de genes homólogos a algunos descritos en S. typhimurium (Behlau y Miller, 1993; Kaniga y col., 1994, 1995).
En los últimos diez años se ha logrado descifrar un gran número de genes involucrados en el proceso de entrada de S. typhimurium a células epiteliales. La mayoría de los genes identificados están agrupados en zonas específicas del cromosoma, de gran tamaño, denominadas "islas de patogenicidad", que probablemente han sido adquiridas por transferencia horizontal, ya que presentan un contenido de G+C distinto del promedio de la bacteria (Hacker y col., 1997). En S. typhimurium se han definido cuatro islas de patogenicidad, SPI, que están presentes en aislados clínicos virulentos y ausentes en las cepas no virulentas, participando directa o indirectamente en los eventos de entrada de la bacteria a las células epiteliales y la sobrevida en el interior de los macrófagos (Galán, 1996; Shea y col., 1996; Blanc-Potard y Groisman, 1997; Wong y col., 1998). Tres de estas SPI han sido detectadas en S. typhi (Ochman y Groisman, 1996; Wong y col., 1998).
La mayoría de los genes involucrados en el proceso de invasión a células epiteliales, descritos hasta ahora, están agrupados en la SPI 1. Ésta es específica para Salmonella y se ubica en el minuto 63 del cromosoma de S. typhimurium (Galán, 1996). Gran parte de los genes presentes en la SPI 1, entre ellos el locus inv/spa, codifican para genes estructurales y regulatorios de un nuevo sistema de secreción, denominado tipo III (Galán, 1996). Este aparato de secreción permitiría exportar algunas proteínas, codificadas también en este locus, a la superficie bacteriana de S. typhimurium. Se ha visto que este sistema de secreción permitiría además translocar algunas proteínas directamente al citoplasma de la célula epitelial (Collazo y col., 1995; Wood y col., 1996; Collazo y Galán, 1997). No se ha establecido aún si las proteínas caracterizadas en estos trabajos son los verdaderos efectores que inducirían la internalización de la bacteria. El sistema de secreción sería específico para la secreción de factores de virulencia. Un análisis de la secuencia de los genes que codifican para este aparato de secreción indican que existen sistemas semejantes en otros enteropatógenos como Shigella y Yersinia y también en fitopatógenos como Pseudomonas solanacearum y Xanthomonas campestris y presentan además alta homología con los genes involucrados en el ensamblaje del flagelo de E. coli (Van Gijsegem y col., 1993).
La segunda SPI caracterizada en S. typhimurium, SPI 2, fue descubierta mediante selección negativa de aquellas mutantes incapaces de sobrevivir en el ratón y se ubica en el minuto 31 del mapa de S. typhimurium (Hensel y col., 1995). El análisis de la secuencia de los genes involucrados en este loci, indicó que también codificaría para un aparato secretor tipo III, cuya expresión sería importante en la sobrevida de la bacteria dentro de los macrófagos y por lo tanto en la virulencia del enteropatógeno (Shea y col., 1996).
Las estrategias genéticas más recientes utilizadas para la identificación de genes implicados en la virulencia bacteriana, se basan en la obtención de mutantes que disminuyen o pierden su capacidad virulenta, usando al animal como medio de selección. Una de ellas se denomina IVET (tecnología de expresión in vivo), que permite el aislamiento de genes bacterianos específicamente inducidos durante la infección. Para ello, se utilizan genes reporteros sin promotor propio, que codifican para una vía sintética que complementa un defecto metabólico de la bacteria receptora. Éste se expresa sólo cuando la construcción génica queda bajo el promotor de un gen que se induce durante el ciclo infectivo de la bacteria. De esta forma, al infectar un ratón con un grupo de mutantes, se recuperan desde los órganos internos sólo aquellas mutantes capaces de sobrevivir en el ratón (Heithoff y col., 1997). Otro sistema que ha aportado importante información respecto a los genes de virulencia en S. typhimurium es el método de selección negativa por el cual se identificó la SPI 2, que consiste en marcar individualmente cada mutante con un transposón que lleva un segmento de DNA generado al azar y que es diferente para cada clon. Esta marcación permite reconocer los clones ausentes en el grupo de mutantes recuperadas desde el ratón infectado, lo que implica que corresponden a clones incapaces de sobrevivir en el ratón (Hensel y col., 1995).
Utilizando estas técnicas, se ha demostrado que no sólo los genes tradicional-mente involucrados en el fenotipo invasor, como los ya mencionados, o aquéllos que codifican para toxinas son importantes en la virulencia bacteriana, sino también algunos genes implicados en el metabolismo general o también llamados "housekeeping genes".
Algunos de los genes identificados usando estas estrategias génicas codifican para funciones regulatorias, los que permitirían responder coordinando la expresión de los factores de virulencia necesarios en un determinado momento (phoP/phoQ; envZ/ompR). Un importante número de genes inducidos durante la infección corresponden a genes metabólicos, que probablemente pueden contribuir a la sobrevida del patógeno y su persistencia en condiciones limitadas de nutrientes. Es factible también que no sean esenciales para la virulencia de la bacteria debido a sus funciones bioquímicas, sino que podrían cumplir otros roles en el proceso de infección (Hensel y col., 1995; Heithoff y col., 1997).
Estos resultados han puesto en discusión la definición de factores de virulencia, que en un sentido más amplio acepta que cualquier propiedad que le permita al patógeno entrar, crecer o sobrevivir en el hospedero podría ser considerado como factor de virulencia. Esto incluye por ejemplo: antígenos de superficie que eviten los efectos del complemento; estructuras de la bacteria que permitan adherirse a las células blanco; sistemas reguladores que le permitan adaptarse a las condiciones ambientales que el hospedero ofrece, e incluso actividades enzimáticas que le permitan sintetizar nutrientes que no están disponibles en el hospedero (Slauch y col., 1997).
La interacción bacteria-hospedero en el ciclo infectivo de un parásito intracelular facultativo es un proceso dinámico, durante el cual el patógeno está expuesto a diversos ambientes intra- y extracelulares. Estos cambios son percibidos por la bacteria, provocando una respuesta que le permite adaptarse a las nuevas condiciones y sobrevivir en ellas (Mekalanos, 1992).
La expresión de muchos, si no todos, los genes requeridos para la invasión a células epiteliales está finamente regulada en respuesta a las condiciones ambientales presentes en el intestino, donde prima la baja disponibilidad de oxígeno, la carencia de hierro y la alta osmolaridad entre otros (Mekalanos, 1992).
Se ha demostrado por ejemplo, que S. typhimurium crecida en condiciones anaeróbicas aumenta su capacidad invasora en células en cultivo respecto a la bacteria crecida aeróbicamente (Schiemann y Shope, 1991). Además, se han aislado genes inducidos en anaerobiosis, por ejemplo el gen orgA codificado en la SPI 1, que al ser mutados hacen a la bacteria menos virulenta que la cepa silvestre (atenuada). La proteína deducida para el gen orgA no presenta similitud con proteínas conocidas y se desconoce hasta la fecha su función y su relación con el fenotipo invasor (Jones y Falkow, 1994).
Los enteropatógenos están presentes en aguas contaminadas, donde el ambiente generalmente presenta temperatura y osmolaridad menor que aquéllas que la bacteria encuentra en el hospedero. Se ha demostrado que cambios en estos parámetros influyen sobre la capacidad de la bacteria de invadir células en cultivo. Shigella flexneri por ejemplo, es virulenta in vivo a 37°C pero no a 30°C, hecho que correlaciona con la capacidad de invadir cultivos celulares a 37°C, y no a 30°C (Maurelli y col., 1984; Maurelli y Sansonetti, 1988).
Consecuentemente, no sólo el fenotipo invasor es afectado por las condiciones ambientales, sino también la expresión de genes involucrados en este fenotipo es modificada por las condiciones del medio ambiente. Usando como gen reportero lacZ fusionado a genes involucrados en el fenotipo invasor, se demostró que la variación de pH, disponibilidad de oxígeno y osmolaridad modifican la expresión de estos genes (Bajaj y col., 1996). Además, se demostró que estas variaciones son dependientes del regulador transcripcional HilA (Bajaj y col., 1995). Este regulador coordinaría la expresión de los genes pertenecientes a la SPI 1 de acuerdo a las condiciones del medio ambiente, para favorecer la expresión del fenotipo invasor cuando la bacteria reconoce las condiciones ambientales que encuentra en el interior del hospedero (Bajaj y col., 1996).
Los mecanismos por los cuales la bacteria responde a los cambios del medio ambiente, en general se basan en los sistemas de regulación de dos componentes. Están constituídos por una proteína sensora, generalmente inserta en la membrana citoplásmica que transmite la señal al segundo componente que es el regulador, proteína soluble que puede unirse al DNA y modificar su expresión. El gen hilA, que forma parte de la SPI, codifica para el regulador HilA y presenta similitud de secuencia con reguladores del tipo OmpR/ToxR, pertenecientes al sistema clásico de regulación de dos componentes (Bajaj y col., 1995). Otro ejemplo de genes reguladores de la expresión de determinantes de virulencia, lo constituye el sistema phoP/phoQ descrito en S. typhimurium. Este sistema regula la expresión de los genes pag (activados por PhoP) y los genes prg (reprimidos por PhoP), involucrados en la capacidad de sobrevivir dentro del macrófago (Miller y col., 1991) y también coordinaría la regulación del fenotipo invasor en células epiteliales a través de los genes prgH y hilA (Behlau y Miller, 1993; Bajaj y col., 1996).
La variación de la topología del DNA representa una forma de control global que tiene el potencial de influir en la expresión de algunos genes bacterianos, constituyéndose en uno de los mecanismos de regulación de la expresión de factores de virulencia (Dorman y Ni Brhiain, 1993). Esto se llevaría a cabo a través de las enzimas del tipo topoisomerasas y a través de proteínas que forman parte de la arquitectura del DNA. Se ha relacionado la regulación de los factores de virulencia de Shigella, tanto por osmolaridad como por temperatura, a la expresión de la proteína H-NS, que reprimiría la expresión génica a baja temperatura y baja osmolaridad. Esta proteína es una proteína tipo histona involucrada en los cambios de topología del DNA y que originalmente se describió como el regulador VirR (Porter y Dorman, 1994). En S. typhi y S. typhimurium también se ha descrito que el fenotipo invasor es regulado por cambios en la osmolaridad del medio debido a cambios en la topología del DNA (Galán y Curtiss III, 1990; Tartera y Metcalf, 1993).
