Comparaison de la méthode d’ATPmétrie

et la microbiologie traditionnelle

1.Procédure d’utilisation du Hylite 2 :

   Il est nécessaire de travailler dans une atmosphère stérile afin d’éviter toute contamination pouvant influencer les résultats.

Il existe deux sortes de prélèvements avec cet appareil :

Les prélèvements liquides

On utilise les « stylos Hylite » composés de :

-         Un stick échantillonneur permettant le prélèvement d’un certain volume d’échantillon. Celui-ci est garni d’un produit chimique destiné à extraire l’ATP.

-         Une cuvette avec une solution destinée à la dilution de l’échantillon.

-         Une chambre à réactifs, scellée par une feuille d’aluminium, contenant le mélange luciférine/luciférase.

L’ensemencement se déroule en plusieurs étapes :

1.     Retirer le stylo de son capuchon et prolonger le stick échantillonneur dans un liquide à analyser. Les stries doivent tremper entièrement dans ce liquide.

2.     Placer le stick échantillonneur sur un support dur et, en maintenant une pression constante, l’enfoncer dans le compartiment en le maintenant à la verticale. A ce stade l’échantillon reste stable 48 heures à température ambiante.

3.     Tourner en forçant dans le sens des aiguilles d’une montre la partie supérieure du stylo contre la partie inférieure de celui-ci. La chambre des réactifs est ainsi ouverte et
permet à la luciférine/luciférase d’être libérée.

4.     Afin de bien mélanger les réactifs, secouer le stylo énergiquement au minimum dix fois ; il doit apparaître une coloration jaune avec formation de mousse.

5. Introduire l’échantillonneur dans la chambre de mesure du Hylite2 et lire le résultat en ULR sur l’écran.

Les prélèvements par frottis

Les frottis seront réalisés à l’embouteillage et sur les bouteilles sorties de la laveuse. Pour ce type de prélèvements on utilise des écouvillons « Hylite » et une solution de rinçage « hylite » contenue dans le capuchon du stylo.

Pour le prélèvement :

-Retirer l’écouvillon de l’étui et l’humidifier dans la solution de rinçage.

-Frotter une surface tout en tournant l’écouvillon dans les deux sens. Remettre l’écouvillon dans son étui jusqu’à son analyse.

Au laboratoire, les stylos utilisés sont pratiquement les mêmes que pour les prélèvements liquides ; ils contiennent en plus une solution de rinçage qui permet d’humidifier l’écouvillon.

L’ensemencement se déroule en plusieurs étapes :

1. .Rincer l’écouvillon dans la solution de rinçage du stylo en la tournant.

2. .Retirer le stylo de son capuchon et plonger le stick échantillonneur dans la solution de rinçage. Les stries doivent plonger entièrement dans la solution.

3. .Placer le stick échantillonneur sur un support dur et, en maintenant une pression constante l’enfoncer dans le compartiment en le maintenant à la verticale.

4. .Tourner, en forçant dans le sens des aiguilles d’une montre, la partie supérieure du stylo contre la partie inférieure jusqu’à ce que le vissage soit complet. La chambre des réactifs est alors ouverte et la luciférine/luciférase est libérée.

5. .Afin d’homogénéiser le milieu, secouer le stylo énergiquement dix fois minimum, il il doit avoir apparaître une coloration jaune-verte avec formation de mousse.

6.     .Introduire l’échantillonneur dans la chambre de mesure du Hylite2 et litre le résultat en ULR sur l’écran.

2.La microbiologie traditionnelle :

Préparation et stérilisation d’un filtre à membrane :

Le but de cette technique est de filtrer un liquide (bière ou eau de tanks lavés) sur un «  filtre à membrane »  stérile pour la recherche de bactéries et/ou levures.

Mode opératoire :

1. En fonction du nombre de prélèvements, flamber une ou plusieurs plaques perforées (support de la membrane) avec la pompe à vide en fonctionnement. Ouvrir le robinet d’évacuation 3 à 4 fois

.

2. Les entonnoirs seront apposés sur une plaque chauffante et ensuite soigneusement séchés.

3. Flamber la base de l’entonnoir avec le bec bunsen, puis le cône intérieur. L’entonnoir sera maintenu par l’anse de verrouillage.

4. Flamber l’entonnoir sur le support et verrouiller.

5. Mettre une ou des membrane(s) sur la ou les plaques perforée(s).

6. Vider le contenu de l’échantillon en une fois (en évitant les coulées extérieures).

7. Fermer les robinets lorsque tout l’échantillon est filtré (afin d’éviter toute infection).

8. Couper la membrane en deux parties à l’aide d’un bistouri stérile.

9. Déposer les membranes dans des milieux de cultures.

(voir photos en annexe)

Nature de la détérioration de la bière par les bactéries :

I. Bactéries détériorant la bière :

Ce sont toutes les bactéries qui se développent dans le produit à tous les stades de la fabrication et qui provoquent un goût, un aspect indésirable, une odeur à la bière.

II. Les différents types de détérioration :

1.Voile – trouble.

Ce voile ou trouble devient visible en présence d’un grand nombre de bactéries.

2.Viscosité

Cette viscosité peut aller jusqu’à un aspect huileux.

3. « Faux goûts » :

-         Acide : Certaines bactéries transforment les hydrates de carbone en de nombreux acides(lactique, acétique, succinique)

-         Diacétyle : Provoqué par les bactéries lactiques et donnent un goût de beurre.

-         Autres faux goûts : Céleri, cidre, pourriture, pomme.

III. Bactéries rencontrées en Brasserie :

1.Lactobacillus :

-         Peuvent être responsables d’acidités.

-         Peuvent hydrolyser les dextrines et l’amidon en sucres fermentescibles, ce qui résultera en une super atténuation du moût.

-         Ils forment l’acidité, trouble, viscosité et odeurs désagréables dans la bière.

2.Pédiocoques :

-     Forment du dyacétyle et de l’acide lactique dans la bière.

-     Responsables de viscosité.

3.Acétobacter, Pseudomonas :

-     Produisent l’acidité.

-     Confèrent un voile trouble.

-     Acétobacter sont des oxydants puissants.

4.Zymononas :

-     Produit de l’acétaldéhyde et du H₂S qui confèrent à la bière un goût de pomme pourrie.

-     Il forme un trouble soyeux et augmente la viscosité.

5.Pectinatus :

-     On retrouve généralement le pectinatus dans les bières à faible teneur en alcool.

6.Entérobactérie :

-     Diminue la vitesse de fermentation.

-     Produit des goûts fruités (ces faux goûts peuvent persister jusque dans le produit final).

Nature de la détérioration de la bière par les levures sauvages :

Les levures sauvages :

Une levure sauvage peut être définie comme une levure que l’on n’emploie pas délibérément, en d’autres termes, toute levure de race autre que celle de la levure de culture utilisée pour la fermentation.

Toutes les levures sauvages ne détériorent pas la bière, mais leur présence est un signe de contamination.

Problèmes liés à la présence de levures sauvages :

1.Trouble :

Le trouble peut avoir son origine dans la croissance de levures sauvages restant après filtration.

2.Formation d’une pellicule en surface :

En présence d’air, les levures qui forment un film peuvent se multiplier très rapidement et provoquer un trouble.

3. « Faux goûts » :

Les faux goûts peuvent prévenir du métabolisme de toutes les levures sauvages.

4.Super atténuation :

Saccharomyces diastaticus provoquent une infection dangereuse.

Outre le fait qu’elle génère un trouble et un faux goût, elle peut fermenter l’amidon et les dextrines, en conduisant à une atténuation anormale de la bière.

Les milieux de culture :

Les milieux de culture utilisés au laboratoire de la brasserie Jupiler sont les suivants : NUTRIMENT, MG, WL, WLD, MRS et MSP. Pour plus de renseignements sur l’origine, la composition, la préparation de ces milieux et tableaux voir l’annexe.

1.M.G.

Nom : Mout Gélosé.

Consistance : Milieu solide.

Incubation : 3 jours en anaérobiose.

Utilisation : contrôle du moût, de la bière à la sortie des filtres, en canetterie, au soutirage fûts et à l’embouteillage.

Microorganismes détectés : bactéries anaérobies et levures (de culture ou sauvages).

2.M.R.S.

Nom : Milieu de Man, Rogosa et Sharpe.

Consistance : Milieu solide.

Incubation : 8 jours en anaérobiose

Utilisation : contrôle de la bière à la sortie des filtres, en canetterie, au soutirage fûts et à l’embouteillage.

Microorganismes détectés : bactéries lactiques (Pediococcus, Lactobacillus).

3.M.S.P.

Nom : Milieu Spécial.

Consistance : Milieu liquide.

Incubation : 21 jours en anaérobiose.

Utilisation : contrôle du moût, de la bière à l’entrée et à la sortie des filtres et aussi la bière en garde.

Microorganismes détectés : bactéries lactiques

4.NUTRIMENT.

Nom : Nutriment Agar.

Consistance : Milieu solide.

Incubation : 3 jours en anaérobiose.

Utilisation : contrôle des eaux.

Microorganismes détectés : microflore totale de l’eau.

5.W.L.

Nom : Wallerstein Laboratories Nutriment medium.

Consistance : Milieu solide.

Incubation : 3 jours en aérobiose.

Utilisation : contrôle des frottis de soutireuses et des bacs à désinfectants.

Microorganismes détectés : bactéries aérobies et levures (de culture ou sauvage).

6.W.L.D.

Nom : Wallerstein Laboratories Différential medium.

Consistance : Milieu solide.

Incubation : 3 jours en aérobiose.

Utilisation : contrôle de la bière en garde et en traversage.

Microorganismes détectés : bactéries aérobies.

3. Résultats de la comparaison des méthodes :

J’ai effectué des prélèvements hylite et micro sur la chaîne de fabrication. Il y a trois groupes de production que l’on inspecte chaque lundi. Voici les résultats de mes prélèvements.

Conclusion :

Lors de ces tests, nous pouvons remarquer que les résultats Hylite sont plus élevés que ceux de la Micro. Ce qui est logique car les résidus de bière contiennent de l’ATP. Nous avons voulu savoir s’il existait un rapport entre la microbiologie traditionnelle, utilisée en brasserie, et l’ATPmétrie. Pour ce faire, nous avons parallèlement à un test Hylite, réalisé un contrôle microbiologique dans les conditions de travail habituelles. Généralement, on utilisait des milieux dit sélectifs, tandis que l’appareil détecte toute sorte de microorganisme sans exception. Nous en avons déduit qu ‘il n’y avait aucun liens entre ces deux méthodes.

La seule chose que l’on peut affirmer est que lorsque l’on atteint une valeur supérieure à 2000 ULR, on est certain d’être positif en microbiologie.

Feuilles en annexe :

4. Préparation et composition des milieux de culture :

1.Moût gélosé

1. Filtrer le moût houblonné.

2. Ajouter 8g d’agar.

3. Ajouter 8mg de bromocrésol.

4. Chauffer au micro-ondes, jusqu’à dissolution complète.

5. Stériliser à l’autoclave (40 minutes).

2.M.R.S.

1 .Peser 28g de M.R.S. Agar :

Formule :

Peptone                                   10g/L

Extrait de bœuf            10g/L

Extrait de levures                      5g/L

Dextrose                                 20g/L

Tween 80                                  1g/L

Citrate d’ammonium                  2g/L

Acétate de sodium                     5g/L

Sulfate de magnésium   0.1g/L

Sulfate de manganèse               0.05g/L

Phosphate dipotassique              2g/L

Agar                                        15g/L

2. Ajouter 16ml de moût non houblonné, bouilli et filtré.

3. Ajouter 200ml de triple (bière Piedboeuf)

4. Ajouter 200ml d’eau déminéralisée.

5. Ajouter 8mg d’actidione.

6. Dissoudre au micro-onde et auto claver 40 minutes.

3.Milieu spécial.

1. Dans 5 litres de moût non houblonné :

-250g de Peptonized milk.

-2.5g de Sulfate de manganèse.

-0.5g de dihydrogènophosphate de potassium.

-50g de maltose.

-1g d’extrait de levure.

Mettre une nuit au frigo (éviter de faire mousser la bière).

2. Verser le tout dans un fût de Jupiler (ayant passé la nuit au frigo) à l’aide d’un entonnoir spécial permettant d’évacuer le surplus de bière.

Ajouter 20ml d’eau distillée contenant 3g d’acide ascorbique et 1g d’actidione.

Ajouter 13ml de NH_3.

3. Dissoudre au micro-onde et auto claver 40 minutes.

4.Nutriment Agar.

1.Peser 9.2g de Nutriment Agar

Formule :

Extrait de bœuf :                      3g/L.

Peptine :                                  5g/L.

Agar :                                      15g/L

2. Ajouter de l’eau déminéralisée jusqu’à 400ml.

3. Dissoudre au micro-onde et auto claver 40 minutes.

5.W.L.N.

1.Peser 32g de W.L.N

Formule :

Glucose                       20g/L

KH₂PO₄                             0.55g/L

KCl                             0.425g/L

CaCl₂.2H₂O                0.125g/L

MgSO₄.7H₂O              0.125g/L

MnSO₄.4H₂O              2.5g/L

FeCl₃. H₂O                  2.5g/L

Hydroxylat de caséine  5g/L

Extrait de levure                       4g/L

Vert de bromocrésol                22mg/L

Agar                            20g/L

2. Ajouter de l’eau distillée jusqu’à 400ml.

3. Dissoudre au micro-onde et autoclaver 40 minutes.

6.W.L.D.

1. Peser 32g de W.L.D.

Formule :

La composition de ce milieu est identique au W.L.N., elle contient seulement 0.004g/L d’actidione en plus.

2. Ajouter de l’eau déminéralisée jusqu’à 400ml.

3. Dissoudre au micro-onde et autoclaver 40 minutes.

5. Bibliographie :

-         Bibliothèque Interbrew Jupille : documentation générale.

-         Hylite 2 : Manuel d’utilisation, firme MERKS 2000.

-         GIRARD S. ; Guide de la bière et de ses à cotés, Ed Temps Actuels, 1983.

-         http ://www. Interbrew. be

-         http ://www.chez.com/microbiologie/lessivage.htm

-         La Fabrication de la bière : Brasserie Piedboeuf, Jupille-sur-Meuse, 1985.

-         GIRARD S. ; Etude HACCP et contrôle de qualité physico-chimique et microbiologique, Université de Bourgogne Dijon, Maîtrise 1999-2000.

Remerciements :

Je voudrais remercier monsieur Pierre Nihoul (chef de labo) qui m’a permis d’effectuer mon stage chez Interbrew, messieurs Luc Martin (Maître de stage), Joseph Langner et Frédéric Mathijsen (Laborantins) qui m’ont énormément appris tout au long de mon stage. Et surtout les responsables de ma section qui ont ouvert  une section fantastique.