10-INFEZIONI DA MICOBATTERI.

 MICOBATTERI TUBERCOLARI E MOTT.

 

   I campioni che provengono in laboratorio per la diagnosi batteriologica di infezione tubercolare sono soprattutto espettorati, broncoaspirati, urine, liquidi pleurici, liquor cefalorachidiano, secrezioni purulente. L'aspirato gastrico si usa nella diagnosi di TBC polmonare nei bambini e nei pazienti che non espettorano bene .

Poichè partiamo da materiali contaminati (ad eccezione del LCR) va fatta prima una decontaminazione del campione. Nel caso delle urine (metodo di raccolta 1 campione di 50 cc di  urine del primo mitto per 3 giorni consecutivi, totale 3 campioni da 50 cc ) facciamo una centrifugazione preliminare a 3900 rpm per 15 minuti. La migliore decontaminazione degli escreati avviene usando NaOH (soda caustica) al 2% in rapporto 1:1 che diventa NaOH al 1% finale quando si pone in eguale volume di espettorato-escreato. Nel caso dei sedimenti urinari si fa un pool dei 3 sedimenti e si aggiunge la soda in egual volume.

Dopo almeno 15 minuti (diciamo 15-30 minuti)  aggiungiamo il tampone fosfato a pH 6.8 per neutralizzare la miscela .Nel kit (Becton Dickinson) dentro il flacone di soda abbiamo una fialetta contenente acetil cisteina in plovere.Schiacciamo la fialetta che si scioglie nella soda.. Aggiungiamo questa miscela in egual misura nell'espettorato.Ci aiutiamo con un ansa per staccare l'espettorato e versarlo in una provetta da 50 cc con tappo a vite.La miscela espettoralo+ decontaminante/fluidificante non deve superare i 20-25 cc.Dopo di che vortexiamo per 20-30 secondi e osserviamo come il nostro campione si scioglie.Nel caso sia particolarmente vischioso si aggiunge altra soluzione decontaminate/fluidificante.

Altra variante del metodo : Tutti i campioni vengono fluidificati con sputasol (ditiotreitolo ).Decontaminati con NaOH al 2-3% in parti uguali per 15'.Dopo la decontaminazione è stato aggiunto un egual volume di tampone fosfato pH 6.8 e i campioni vengono centrifugati a 3000 rpm/per 20 minuti il sedimento è stato risospeso in 2 ml di tampone fosfato e neutralizzato con HCl 1 N (aggiungere una goccia di rosso fenolo che dal rosso vira a incolore a pH neutro).

 

Reagenti di decontaminazion/fluidificazione  per Litro di acqua distillata

NaOH 20 gr

Citrato trisodico 14,5 gr.

N-AcetilCisteina 0.375 gr

Tampone fosfato per 500 mL di acqua distillata:

Fosfato di sodico Na2HPO4 2,37 gr

Fosfato monopotassico KH2PO4 2,27 gr

 

Domande sulla preparazione del campione:

1) Perchè il campione va decontaminato?

Il campione va decontaminato perchè la maggior parte dei campioni che arrivano in laboratorio sono contaminati da flora residente a crescita rapida.

2) Perchè il campione va fluidificato?

Il campione vischioso come l'espettorato, va fluidificato perchè la fluidificazione libera eventuali micobatteri e germi comuni.In questo modo sia la decontaminazione sia il recupero dei micobatteri è piu' efficace.

3)La soda e l'N acetil cisteina hanno un effetto sinergico?

Si perchè la soda ha un effetto di per se stesso fluidificante come l'acetil cisteina.Per esperienza anche la sola soda fluidifica il muco.Un vecchio metodo (mi pare si chiamasse di Petroff prevedeva la sola soda al 4% che fluidificava di per se stessa.Metodo invero molto aggressivo e che richiedeva una antipatica neutralizzazione con HCl dopo tamponamento con fosfato)

4)Si osservano cellule epiteliali o neutrofili nel campione trattato?

No perchè la soda rompe le cellule epiteliali. I neutrofili sono piu' resistenti ma anche essi vengono "digeriti". Cio' rende il campione per l'osservazione al microscopio piuttosto pulito a differenza del metodo con cloruro di benzalconio(Biomerieux).

5)Qual'è la concentrazione di Soda iniziale?

E' del 2% .Aggiungendo a un eguale volume di campione si ha una soluzione finale dell'1% che non è lesiva per i micobatteri.

6)Perchè nel reattivo c'è anche il citrato di sodio?

Il citrato di sodio lega gli ioni ferro  e di metalli pesanti che inattiverebbero l'NALC

7)Perchè l'N-AcetilCisteina è contenuta in polvere?

Perchè in soluzione è un agente mucolitico piuttosto instabile .

8)Il ditiotreitolo o sputasol è piu' stabile dell'acetilcisteina?

Si. Una soluzione di ditiotreitolo puo' essere efficace anche per una settimana mentre una di N acetil cisteina dura 24 ore.

9)A che serve il tampone fosfato a pH 6,8?

L'aggiunta di tampone fosfato diluisce la soda e quindi la inattiva,abbassa il peso specifico del campione permettendo una ottimale centrifugazione dei micobatteri .

10) Qual'è il volume di campione da usare?

Non si devono superare i 10 ml di campione in un provettone con tappo a vite da 50 ml.

11)Se il campione è particolarmente vischioso che fare?

Si aggiunge altra NaOH-NALC e si vortexa.

12)Per quanto tempo si deve vortexare?

Il mio consiglio è di non vortexare per piu' di 20-30 secondi. In questo tempo si ha la liquefazione completa del campione.

13)Quanto tempo va tenuto il campione a decontaminare?

15-30 minuti a temperatura ambiente.

14)Quali sono le condizioni di centrifugazione finale ?

3900 rpm per 15 minuti cioè 3000g per 15minuti.

15)Come si approntano i vetrini e la coltura?

Dopo aver decantato attentamente si aggiunge di nuovo del tampone fosfato  diciamo 1 ml e si risospende delicatamente.

16)Qual'è il volume di sedimento tamponato che si inietta in bottiglia?

da 0,5ml a 1 ml

18)Qual'è il volume di sedimento tamponato che si semina nei terreni solidi Lowenstein Jensen?

200 µL cioè il volume che ricopre la superficie delle provette a becco di clarino.

17) Come si trattano i campioni di urina?

Si fa un pool con il sedimento.Un primo sedimento si risospende in soda/N acetil cisteina che risospende un secondo sedimento che risospende il terzo sedimento.Poichè l'urina puo' essere un materiale piu' sporco dell'espttorato si puo' aggiungere piu' decontaminate , diciamo il doppio del volume del pool dis edimenti.Non è necessaria la N- acetil cisteina.

16)Dove si buttano i sovranatanti?

In un recipiente contenente Ipoclorito di sodio.

     Una parte del sedimento ci occorrerà per il vetrino, il resto con una siringa lo inietteremo nelle bottiglia di Bact/Alert 3D MP cioè terreno liquido Middlesbrook.Andrebbe prima disinfettato il tappo di gomma, iniettato il campione, di nuovo disinfettato .Il disinfettante ideale è a base di fenolo.A questo terreno liquido aggiungeremo 0,5 ml di soluzione antibiotica+ fattori di crescita preparata precedentemente.L'incubazione nel sistema automatico Bact/Alert 3D monitora eventuale sviluppo di CO2. Lasciamo le bottiglie 35-40 giorni prima di refertare negativo.Dalla nostra esperienza con il metodo di coltura liquido non radiometrico i tempi di positivizzazione per un campione francamente positivo (cioè positivo già alla colorazione Ziehl Neelsen) sono di 8-15 giorni! Cio' dipende dalla carica iniziale del campione iniettato.Piu' il paziente è bacillifero piu' la sua coltura si positivizzerà in tempi brevi!

E' raccomandabile seminare in doppio sia su terreno liquido che su provette di Lowenstein Jensen.Noteremo che il Lowenstein Jensen presenta una percentuale di colture piu' inquinate che il terreno liquido dove l'aggiunta di un supplemento antibiotato abbatte il numero di colture fallite anche sotto il 5%.E' dimostrato pero' che con una semina in doppio si recupera qualche positivo che non cresce in terreno liquido.

Come si puo' affrontare questo problema delle colture inquinate?

Posto che un prolungamento della decontaminazione è lesivo anche dei micobatteri, un metodo puo' essere seminare il campione decontaminato in agar cioccolato (si puo' dividere la piastra in 2 o 4 settori) prima della semina sui terreni per micobatteri.Il giorno dopo si controlla la crescita dei batteri sfuggiti alla decontaminazione.Se c'è una forte carica, si riprende il campione decontaminato e si ripete la decontaminazione.Se la carica è bassa si puo' procedere alla semina sui terreni liquidi e LJ confidando che il supplemento antibiotato e il verde malachite siano fattori selettivi sufficienti.

Quando l'apparecchio segnala un sospetto positivo, dal brodo faremo uno Ziehl Neelsen, se si conferma la positività faremo un trapianto sul classico terreno Lowenstein Jensen solido.E' bene seminare il campione positivo su Lowenstein Jensen dove si osservano le colonie e si puo' avere una idea se si tratti di micobatteri tubercolari o non tubercolari.

La  Colorazione di Ziehl-Neelsen

 

Colorazione dei micobatteri,  si basa sulla loro alcool-acido resistenza.I micobatteri appaiono colorati in rosso su uno sfondo blu dove appare blu anche la restante flora microbica.

"Quando si vuole colorare il liquor o un broncoaspirato liquido direttamente, senza centrifugazione , si usa questo metodo pratico di stratificazione:si distende con l'ansa una goccia sul vetrino, attendendo che questa asciughi e ripetendo successivamente l'operazione con altre due o tre ansate di materiale.Il fissaggio si esegue o alla fiamma o con metanolo."

Una volta asciugato il campione su vetrino si puo':

1)fissarlo in metanolo puro per almeno 1 minuto

2)fissarlo in piastra calda 75°-80°C per 10 minuti

3)fissarlo alla fiamma di un becco Bunsen per qualche secondo

4)Lasciarlo in termostato a 37°C per almeno 48 ore

A caldo:

1)Colorare per 5 minuti con la Fucsina di Ziehl (sinonimo carbol fucsina o fucsina fenicata o fucsina contenente fenolo), passando una fiamma sotto il vetrino, in modo che si formino vapori per tutta la durata della colorazione (tenere sotto cappa aspirante!)

A freddo

1) Colorare per almeno mezzora con la Fucsina di Ziehl

 

2)Lavare con acqua di fonte

3)Decolorare con acido solforico al 20% per 1-2 minuti.Il preparato diventa giallo.

4)lavare con acqua di fonte

5)proseguire la decolorazione con alcool denaturato per 1-2 minuti finchè il preparato non cede piu' colore

6)Lavare con acqua di fonte

7)Contrastare per 5 minuti con blu di metilene

8)lavare con acqua di fonte, asciugare in termostato osservare con microscopio a immersione.

Fucsina basica............0,3 gr

Alcool etilico 95%.....10 ml

Cristalli di fenolo sciolti a caldo....5 ml

Acqua distillata..........95 ml

Prima si scioglie la fucsina basica in alcool poi si scioglie il fenolo in acqua.Si uniscono le due soluzioni.Si aspetta qualche giorno prima dell'uso (ora per fortuna è tutto già pronto all'uso!)

Al posto dell'acido solforico 20% possiamo usare una soluzione del 3% di acido cloridrico in alcool denaturato. Eviteremo il passaggio 5.

Il colore rosso dei micobatteri non è omogeneo.L'intensità del colore dipende  se la colorazione è stata a caldo o a freddo. A caldo il rosso è piu' intenso,piu' brillante.Quando si colora una coltura liquida positiva si nota che i micobatteri si trovano in gruppo a forma di V .Cio' è tipico del micobatterio della tubercolosi per presenza del cosidetto fattore cordale.Anche nella foto a sinistra di un diretto si nota che i micobatteri tubercolari si presentano in gruppo.

"Presentano un componente di natura glicolipidica detto“fattore cordale” tale componente conferisce la tendenza ai bacilli a crescere in ammassi cordonali, serpentiniformi nei terreni liquidi"

 

 

Refertazione di un esame diretto (x1000 a immersione o x 400 in fluorescenza)

Nessun bastoncello AAR osservato negativo Non si osservano bastoncelli alcool acido resistenti
da 1 a 3 BAAR per vetrino 1+ Si osservano rari bastoncelli alcool acido resistenti
da1 a 9 BAAR per 10 campi 2+ Si osservano alcuni bastoncelli alcool acido resistenti
da 1 a 9 BAAR per campo 3+ Si osservano numerosi bastoncelli alcool acido resistenti
>9 BAAR per campo 4+ Si osservano numerosissimi bastoncelli alcool acido resistenti

Il vecchio  Il Bactec 13 A medium al carbonio 14 è un mezzo radiometrico con tutte le limitazioni del caso. Si può rompere la bottiglia!Il suo uso richiede autorizzazioni.Il brodo contiene acido palmitico al carbonio 14 . La presenza di micobatteri sviluppa C(14)O2. L'ago nella fase gassosa aspira l'aria che rimpiazza con CO2 normale. L'ago viene sterilizzato dopo ogni prelievo.

Ecco che cosa possiamo ottenere abbinando coltura e vetrino:

microscopia coltura
+ +
+ -

Nel caso di coltura negativa su vetrino positivo per bastoncelli alcool-acido resistenti possiamo trovarci di fronte a micobatteri a sviluppo condizionato quali M. marinum che dà nfezioni cutanee in soggetti che hanno acquari con pesci tropicali. M. marinum cresce a 30° C . M. haemolyticum,M. paratuberculosis, M. genavense sono micobatteri atipici esigenti.Oppure è il caso di micobatteri da pazienti in terapia. M. haemolyticum richiede l'aggiunta al Lowenstein Jensen di citrato ferrico ammoniacale che si aggiunge al terreno e si lascia assorbire per una notte.M. genavense cresce in terreni liquidi. M.celatum si confonde con altre specie , resistente alla Rifampicina, il genotipo 1 crossreagisce nei test molecolari.E' responasabile di linfoadeniti del collo del bambino.

 

Foto di una coltura di micobatterio atipico trovato su paziente di origine etiope ricoverato da mesi in Malattie infettive.E' un fotocromogeno (=le colonie diventano di colore arancio quando esposte almeno due ore alla luce diretta) con colture rugose.Il quadro clinico e la statistica dei MOTT mi ha fatto ritenere che trattasi di M. kansasii .Purtroppo la tipizzazione dei micobatteri non tubercolari non è semplice per chi non dispone del sistema INNO-Lipa.Il ceppo andrebbe inviato a Centri di riferimento quali il Centro di riferimento Regionale dell'Ospedale Careggi di Firenze (referente:dott.Enrico Tortoli)

Questo simpatico sito che si occupa di TBC e micobatteriosi atipica.

http://www.tbandu.co.uk/

 

Le pseudoepidemie da micobatteri atipici sono dovute a broncoscopi contaminati.

La bottiglia positiva viene mandata al settore di Biologia molecolare per conferma di Micobatterio tubercolare complex cioè M. tuberculosis hominis o M.tuberculosis bovis (non distingue la biologia molecolare fra i due).

La distinzione fra M. tuberculosis hominis e M. tuberculosis bovis è importante a fini legali in quanto la previdenza assicurativa paga le giornate di malattia solo se si tratta di micobatterio umano.La Biologia molecolare non distingue fra i due che racchiude nel M.T. complex .

Dalla bottiglia positiva alla tipizzazione di MT complex:

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Rapid and Specific Detection of Mycobacterium tuberculosis from Acid-Fast Bacillus Smear-Positive Respiratory Specimens and BacT/ALERT MP Culture Bottles by Using Fluorogenic Probes and Real-Time PCR

Nancimae Miller,1* Tim Cleary,1,2 Günter Kraus,2 Andrea K. Young,2 Gina Spruill,2 and H. James Hnatyszyn2

Department of Pathology,1 Department of Microbiology and Immunology, University of Miami School of Medicine, Miami, Florida 331362
 

Schema di trattamento e refertazione del campione.

Fluidificazione+ decontaminazione

|

                       Vetrino (1-4 giorni)<=========================>Coltura in brodo MP

                      (+ telefonare subito al reparto - refertare come negativo)          (+ da 8 a 20 giorni)<========>(- fino a 35-42 giorni)

conferma mediante biologia molecolare (1 a 10 giorni)

trapianto su Lowenstein Jensen (14 giorni)       <====>             semina su bottiglie antibiotate (10 giorni)

Antimicogramma su LJ (14 giorni)

 

Un referto completo di identificazione e antimicogramma va da 19 giorni a 60 giorni !

 

I vetrini positivi vanno segnalati immediatamente.

Ci deve essere un Manuale di biosicurezza perchè la ricerca del bacillo di Koch è di tutte le operazioni che si eseguono in batteriologia la piu' pericolosa (assieme al colturale per Brucella e Legionella).

 L'isolator è l'emocoltura per lisi centrifugazione. E' un vacutainer con saponina che lisa sia le emazie che i globuli bianchi. Ricordiamo che i micobatteri e in particolare Mycobacterium avium-intracellulare sono batteri intra citoplasmatici. Terreno solido è il Middlebrok 7 H10 o 7 H11. Terreno bifasico è l'MB check oggi Septi check AFB. Middlebrok è un terreno solido trasparente dove le colonie si evidenziano subito dopo incubazione in CO2 al 5%. MGIT è un nuovo sistema . Sono normali provette con al fondo un indicatore fluorescente.Letto alla lampada di Wood il fondello diventa fluorescente.  .E' un sistema liquido non radiometrico che è promettente per i test di sensibilità .

 

Nel nostro laboratorio eseguiamo circa 650 colture l'anno.Le urine vengono raccolte in pool e sono la maggiore richiesta di campioni anche se il risultato è deludente nel senso che raramente abbiamo ottenuto positivi per bacillo di Koch in urine.Il numero di pazienti positivi alla coltura varia ogni anno da 12-16 per una popolazione afferente di 100,000 abitanti.Quindi in Italia ci aspettiamo ogni anno 7200-10,000 pazienti infettivi che sputano bacilli di Koch, cha hanno una TBC attiva.Di questi pazienti positivi circa 1/4 sono extracomunitari.Il numero di micobatteri non tubercolari è in genere ogni anno la metà  cioè 6-8 l'anno.

Colture positive per MTB L'Aquila (100,000 residenti) Stima dei positivi in Italia
18 (12+ 6 extracomunitari) 7200 l'anno + 200 extracomunitari
Colture positive per MOTT  
8  

In un vecchio studio si sono usati 3 sistemi il classico LJ, il metodo di riferimento Bactec radiometrico e l'MB Check.
157 colture erano positive per tutti e 3 i sistemi . Delle 210 colture positive per M. tuberculosis 85 erano positive anche al diretto perchè la carica era alta. La sensibilità del diretto non è eccellente (qui 40%).

  BACTEC MB-CHECK LJ
85 positivi al diretto 82 76 72
125 negativi al diretto carica bassa 111 94 64
210 colturali positivi 193 170 136


IL Bactec non si discute!Ma l'MB check non è male e se abbiniamo MB check al LJ possiamo essere soddisfatti.Riguardo a Mycobacterium avium complex.

  BAC MB CHECK LOWENSTEIN JENSEN
55 colture positive 52 39 27


IL LOWENSTEIN JENSEN NON E' INDICATO PER GLI ATIPICI. Già al vetrino si possono fare identificazioni presuntive.Mentre il NAP contenuto nel BActec divide i TB complex dagli atipici ma non ci dice quale atipico è . L'Accuprobe con sonde genetiche richiede una sospensione di una certa torbidità .E' specifico, rapido, eseguibile su MB check positivo sul brodo centrifugato.L'Hplc è utile per separare e identificare gli acidi micolici a catena lunga di 70-100 atomi di carbonio . Ha la stessa portata del sequenziamento genico!

Due metodiche che usano la tecnologia del DNA direttamente sul campione sono l'amplicor PCR e il TMA transcripatase mediated amplification. TMA della Gen Probe amplifica l'RNA ribosomiale mediante una trascrittasi inversa. Metodica isotermica a 42°C.   Amplicor PCR :DNA lettura in AU TMA :rRNA lettura RLU Il carryover è la contaminazione del DNA amplificato nell'ambiente. I carryover sono responsabili dei falsi positivi. Il DNA è molto più stabile dell'RNA e inoltre l'ambiente è pieno di RNAasi. La reazione di TMA avviene in un unica provetta. La Roche ha inventato l'amperase che distrugge i Dna amplificati.

Le urine danno difficoltà intrinseche nella crescita dei micobatteri. Infezione micobatterica da  riattivazione micobatterica in focolai inattivi di micobatteri Nel sedimento urinario non è omogenea la distribuzione dei micobatteri. Problema dei test di amplificazione:qual'è il gold standard? Di fronte ai falsi positivi con chi ci confrontiamo? Nei falsi negativi ci troviamo di fronte a inibitori? Nelle urine delle 24 ore aumentano i contaminanti da decontaminare.Si sviluppano molto i germi che liquefannio il LJ. L'urina del primo mattino è quella che fa la maggiore clearance della vescica. Eccezionalmente si ricercano i micobatteri su urine delle 24 ore.Il contenitore deve essere trasparente va bene anche una bottiglia di plastica.Si tiene in frigo fra una minzione e l'altra. Aspiro il sovranatante e centrifugo il sedimento. LA SODA DECONTAMINA BENE SE C'E' STATA UNA OTTIMA FLUIDIFICAZIONE.

Studio metodo colturale,Amplicor PCR e AMT Gen Probe:Su 203 campioni di pazienti sospetti tubercolotici: colturale:21 positivi Amplicor :23 positivi Gen Probe AMTD:27 positivi. Il Gold standard pu ò essere considerato la coltura e l'esame diretto o la diagnosi clinica di tubercolosi valutando la reazione alla tubercolina, la sintomatologia,l'RX del torace, e il miglioramento del quadro clinico dopo terapia antitubercolare. Considerando come Gold standard la diagnosi clinica di tubercolosi, la sensibilità e la specificità , il valore predittivo positivo e il valore predittivo negativo di Gen probe AMTD sono 92.8%,99.4%,96.3%,98.9%. L'AMTD si è rilevato superiore all'Amplicor PCR per sensibilità .L'alto valore predittivo negativo significa che questa metodica serve a escludere rapidamente la tubercolosi nella diagnosi differenziale. Riassumendo sensibilità , specificità e valori predittivi dei vari metodi in riferimento alla diagnosi clinica:

metodo sensibilità specificità valore PP valore PN
diretto 68% 99.4% 95% 95.1%
colturale 75% 100% 100% 96.1%
amplicor PCR 82% 100% 100% 97%
AMTD Gen Probe 93% 99.4% 96.3% 99%

L'incremento di sensibilità della coltura è del 7% rispetto al diretto.Ricordiamo che questo studio indica come colturale sia il Lowenstein Jensen che il Bactec 12 B in associazione!

 

 

Il Test della  Niacina

L'ho sempre trovato un test ostico e antipatico (nonchè pericoloso) per differenziare il M.T. hominis da M.T. bovis.Usiamo il BD Niacin Test strip.

1)Si usa una coltura fresca diciamo 3-5 settimane vecchia con una crescita abbondante 3+ su uno slant LJ.

2) Si aggiunge 1,5 ml di soluzione salina o acqua distillata, si emulsiona la crescita e si taglia la superficie del terreno LJ con il loop dell'ansa in modo che la Niacina venga rilasciata nel mezzo. Sospensioni pesanti danno i migliori risultati.

3) Si lascia overnight a 35°C con lo slant inclinato (slant=provetta a becco di clarino)

4)Si esegue il test su 0,6  ml di estratto a cui si aggiunge la striscia. Altri 0,6 ml servono da controllo negativo.

5)Possiamo anche usare un controllo positivo cioè  un dischetto contenente niacina.

6)Osserveremo il colore giallo se il test è positivo,incolore se è negativo.

Nota: ho provato a fare il test della Niacina direttamente dal brodo di una coltura liquida positiva.Ho preso 1,2 ml di brodo, diviso a metà.In una provettina ho inserito la striscia, l'altra era il confronto negativo.Il test è venuto bene.Non so se ci sono in letteratura articoli che parlano del test della niacina direttamente dal brodo centrifugato.

Per informazioni sul test:
 
Michael Sullivan, CLS, CT(ASCP)
International Sales Manager
HARDY DIAGNOSTICS
 
 

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