11-BRUCELLA

La brucellosi è una tipica zoonosi:una infezione degli animali che puo' accidentalmente interessare l'uomo.I più esposti sono pertanto gli allevatori, gli agricoltori, i macellai, i veterinari.Ma ci si puo' accidentalmente infettare bevendo latte non pastorizzato appena munto.La brucellosi nell'infezione umana è sostenuta dalla Brucella melitensis che ha la patogenicità massima per l'uomo, dalla Brucella suis e dalla Brucella abortus con patogenicità decrescente.Secondo pero' studi di ibridazione DNA-DNA, tutte le brucelle consistono di una unica genospecie Brucella melitensis.Ma la tipica distinzione in biovar e biotipi è ancora largamente accettata.

Fig. 1 Brucella abortus , coccobacillo , al microscopio elettronico a scansione SEM.E' chiamato cosi'  perchè il batterio si moltiplica nel bovino nell'utero e nelle ghiandole mammarie provocando aborti .

Questi microrganismi sono dei coccobacilli , possono penetrare attraverso le lesioni di cute o mucose (infezione naturale), sfruttano le vie linfatiche per raggiungere il sangue e poi si diffondono nell'organismo e si installano  nelle cellule del sistema reticoloendoteliale, mostrando particolare predilezione per fegato, linfonodi, milza, midollo osseo e rene. Le Brucelle producono un lipopolisaccaride che media i sintomi della malattia.La risposta anticorpale è meno importante di quella cellulare.E' una infezione difficile da diagnosticare.La febbre dura anche mesi.    Però l'uomo può infettarsi anche per ingestione di alimenti contaminati, soprattutto latte non trattato e suoi derivati (ma anche la carne cruda...), oppure per via aerea inalando escrementi o secrezioni varie, o ancora per inoculazione, ovviamente accidentale, a carico soprattutto di addetti a laboratori e veterinari. L'infezione per contatto è quella che riveste maggiore importanza. La riserva d'infezione maggiore in natura è rappresentata dagli animali domestici, anche se quelli selvatici possono esserne tranquillamente infettati. Soprattutto, ovini, caprini e bovini. Il decorso clinico è spesso inapparente. La sintomatologia si manifesta, dopo un  periodo di incubazione estremamente variabile (da pochi giorni a 6 mesi e più!!), con astenia, malessere generale, cefalea, algie, brividi, febbre che generalmente segue una curva ondulante (alta al pomeriggio, bassa la notte) ma non è la regola. Poi appaiono le  tumefazione dei linfonodi di milza e fegato.Possono anche comparire problemi al sistema nervoso sia centrale che periferico.

Dal punto di vista batteriologico  Brucella è un batterio gram negativo, pleiomorfo (cocco e bacillo), aerobio obbligato, non fermentante,

catalasi e ossidasi positivo.L'idrolisi dell'urea, e la resistenza ai coloranti, con la produzione di H2S, aiutano a differenziare i biovar, mentre la biotipizzazione richiede studi di metabolismo ossidativo e di batteriofagia.

La colorazione di contrasto nel Gram va prolungata per almeno 3 minuti.

E' un parassita endocellulare facoltativo. L'infezione è una caratteristica zoonosi che riguarda ovini, bovini, caprini, cani, renne. L'uomo è un ospite accidentale infettato per ingestione di prodotti contaminati quali latte e suoi derivati e annessi del parto. Rapporti con l'uomo:

B. melitensis +
B. abortus +
B. ovis no
B. suis +
B. neotomae no
B. canis no

  Le brucelle danno patologie acute, subacute o croniche.Un sintomo è la febbre ondulante in B. melitensis.La brucellosi dà uno stato generale di abbattimento, apatia.La Forma subacuta colpisce l'apparato motore, è complicata da meningite, meningo encefalite a liquor limpido .La forma cronica dà uno stato di abbattimento mentale e psichico. I gangli linfatici sono il primo focus infettivo.Incubazione in media di  8-20 giorni , quindi variabile 1-3 settimanema con casi fino a 6 mesi!

La risposta immunologica consiste da un iniziale rialzo del titolo delle immunoglobuline IgM seguita dopo qualche settimana dalle IgG.Quando si comincia il trattamento, il declino del titolo anticorpale è un segno di buona risposta terapeutica agli antibiotici.

Data la disseminazione per via ematica bisogna fare l'emocoltura che va tenuta per almeno 10 giorni.Questi batteri liberano endotossine , responsabili dei picchi febbrili, che provocano una ipersensibilità cellulo mediata di tipo ritardato.I sintomi della infezione possono aumentare o diminuire durante un lungo arco di tempo , in rapporto al rilascio in circolo dei batteri (o dei prodotti di essi, quali il lipopolisaccaride).I macrofagi fagocitano ma non lisano le brucelle che si moltiplicano dentro le cellule.E' un microorganismo esigente.Nelle fasi acute va ricercato nel sangue, mentre nelle fasi croniche nel midollo osseo.Quando la brucellosi è in fase acuta circa il 70% delle emocolture si trovano positive e il titolo delle agglutinine è >= 1.160.Nel 10-15% di questi pazienti si hanno complicazioni quali l'osteomielite .Le colture di midollo osseo sono positive in pazienti con brucellosi acuta, sub acuta e cronica, le emocolture sono positive solo in pazienti in fase acuta.Cresce a pH tra 6.6-7.4.Non è molto stringente riguardo la temperatura di crescita.E' un aerobio stretto.Solo B. abortus è microaerofilo e richiede CO2 al 5-10% (vanno bene dunque le comuni bottiglie da emocoltura per aerobi).In anaerobiosi non crescono.Hanno bisogno di un terreno ricco in aminoacidi e di fattori di accrescimento quali Mg, tiamina (vit B), niacina, biotina.Altre specie richiedono pantotenato di calcio. La base è sempre un tripticase soy agar TSA  (che va bene per le Brucelle meno esigenti), con aggiunta di siero di cavallo al 5% scomplementato, con aggiunta di antibiotici e/o coloranti batteriostatici.

Il prelievo di sangue va fatto una ora prima dell'accesso febbrile ai primi brividi.L'isolamento avviene sul terreno di Castaneda che è stato il primo terreno bifasico.Trattasi di un agar  verticale immerso in un terreno liquido.

Il TS broth è la fase liquida di questo terreno.Si incuba a 37° C e si osserva ogni 4-5 giorni in media 10-15  giorni fino  a  un mese.Fare magari una sottocoltura dalla fase liquida in agar sangue o cioccolato o Brucella agar anche se questo è a rischio di contaminazione della bottiglia da stafilococchi della pelle! Anche sui sistemi di emocoltura in automatico i tempi di isolamento sono di almeno 10 giorni.E' importante usare terreni con CO2 al 5-10%.Facendo un gram della fase liquida osserveremo dei piccoli coccobacilli   colorabili con difficoltà.

Altri campioni  dove cercare le brucelle:

-liquidi sinoviali
-biopsie mediante impressione
-urine raramente
-Ascessi, tessuti che vanno sminuzzati in Ts broth.Le brucelle si liberano dai leucociti :si centrifuga  e si decanta.Il pellet va inoculato su:

-TS agar (con 5% di siero di cavallo) + CO2
-Brucella agar + CO2

Si incuba in CO2 per 10 giorni a 37° C.Una sostanza che rende questi terreni selettiva è il cristalvioletto che pero' è difficile da preparare.Si prepara una soluzione allo 0.1% di Cristal violetto , 1.4 ml di questa soluzione va in 1 litro di terreno. Esiste anche una identificazione diretta delle brucelle , su striscio del buffy coat o da impressione di tessuto   con anticorpi fluorescenti o con il Gram.Ma  i sieri vanno coniugati in laboratorio perchè non sono forniti commercialmente.

Si fa  una identificazione di genere e non di specie.Le colonie osservate sotto luce solare indiretta, appaiono translucide,di colore bluastro.Questo aspetto su Agar Brucella o TSA è utile per la identificazione di Brucella abortus in colture miste, confrontare anche con la coltura in assenza di CO2.Ppossono essere in fase smooth S o rugose R (cio' si osserva bene al microscopio binoculare).

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Una identificazione monospecifica si fa mediante sieri adsorbiti.Cioè mediante sieri adsorbiti su Ag diversi che servono a determinare il lipopolisaccaride predominante M o A.Si testano le colonie in fase S.Questi antigeni sono presenti nelle tre specie di interesse umano, ripartiti inegualmente.L'antigene A domina in B. abortus, M in B. melitensis, mentre sono ugualmente distribuiti in B. suis.

-Nel test di agglutinazione su vetrino, i microorganismi vengono prima sospesi in fenolo e soluzione fisiologica e scaldati a 60 C (gli antigeni sono termostabili) per circa una ora.Si fa una goccia di sospensione e una goccia di siero monospecifico.L'agglutinazione deve avvenire entro 1 minuto.

Come si preparano i sieri monospecifici:L'antisiero è ricavato da animali immunizzati da parte del  ceppo liscio e agglutinano le tre principali specie di Brucella. A e M sono gli epitopi che cross reagiscono.A è il determinante maggiore in B. abortus e B. suis ed è un determinante minore  in B. melitensis. Mentre M predomina in B. melitensis .