9-VALUTAZIONE IN VITRO DELLE RESISTENZE AGLI ANTIBIOTICI.


      Il test di sensibilità agli antibiotici o agenti anti batterici serve non solo per orientare la terapia antibiotica , ma anche per monitorare l'evoluzione della resistenza batterica e dare quindi le basi del trattamento empirico delle infezioni batteriche.La NCCLS  (National Committee for Clinical Laboratory Standards) detta le regole a livello internazionale su come fare i test disensibilità agli antibiotici (antibiogramma), le classi di antibiotici da testare ecc.In pratica questa analisi viene standardizzata in funzione di fattori quali la purezza del ceppo da testare, la densità dell'inoculo, le condizioni di incubazione, il metodo di lettura del risultato e soprattutto i criteri biologici e clinici per l'interpretazione del risultato.Le raccomandazioni della NCCLS possono essere trovate nel sito di questa organizzazione che pero' le invia solo dietro pagamento! E' necessario inoltre iscriversi ai controlli di qualità esterni UK-NEQAS o anche interni  con ceppi standard , per valutare l'accuratezza e la precisione dei test che noi facciamo in laboratorio.Il problema della bassa espressione della resistenza batterica da parte di alcuni fenotipi batterici è la nuova sfida che si pone ai test di sensibilità tradizionale.Un esempio di basso livello di resistenza è quello delle beta lattamasi a spettro allargato o ESBL + che spesso vengono refertati come sensibili ma che comportano il fallimento della terapia antibiotica alla lunga. Da cio' negli apparecchi automatici l'uso di algoritmi interpretativi (sistemi esperti).L'apparecchio referterà il ceppo apparentemente sensibile come resistenteL'analisi statistica degli antibiogramma è utile anche nelle infezioni ospedaliere dove circolano ceppi batterici multiresistenti.

    L'importanza dell'antibiogramma   si basa sul principio che la sensibilita' in vitro prefigura l'efficacia in vivo della terapia antibiotica .Inoltre come detto il controllo della resistenza agli antibiotici nel tempo è la base della terapia empirica.A tal fine distinguiamo  le infezioni come:

-acquisite in comunità

-acquisite in Ospedale

Le resistenze batteriche sono diverse nei due casi dal punto di vista della prevalenza.Esistono batteri che sono naturalmente suscettibili a determinati antibiotici e altri che sono naturalmente resistenti.La resistenza naturale è una caratteristica permanente di una determinata specie .Un batterio naturalmente resistente non puo' diventare suscettibile mentre non è escluso che un batterio naturalmente suscettibile diventi nel tempo resistente.E' il caso recente dello Staphylococcus  aureus che naturalmente suscettibile (sensibile) alla vancomicina ha manifestato in Australia i primi ceppi resistenti ad essa (VISA).

Questa caratteristica dei batteri è anche un aiuto alla loro identificazione nei terreni di coltura selettivi.Per esempio l'agar sangue CNA colistina- acido nalidixico fa crescere solo i batteri gram + che sono naturalmente resistenti a questi 2 antibiotici.

Antibiotici Batteri naturalmente resistenti
Aminoglicosidi Streptococchi-anaerobi
Macrolidi Enterobatteri
Glicopeptidi Batteri gram negativi
Colistina Batteri gram positivi

In generale un marcatore di  gram positività è la vancomicina (usata solo nei batteri gram + sensibili) e di gran negatività è l'acido nalidixico (usata solo nei batteri gran negativi sensibili).

Il problema sorge dalla acquisizione di resistenza da parte di batteri un tempo naturalmente sensibili.Questo è un altro motivo per l'uso dell'antibiogramma nella routine.L'acquisizione della resistenza è dovuta a meccanismi di selezione naturale indotti dall'uso degli stessi antibiotici.

Un caso interessante di studio epidemiologico di resistenza è quello dello Streptococcus pyogenes gruppo A che ha oggi in Italia una certa resistenza alla eritromicina che varia intorno al 30% anche se dal punto di vista della esperienza clinica e quindi in vivo sembra che i macrolidi conservino ancora lo status di antibiotici di elezione dopo le Penicilline.

Quello che andiamo a determinare oggettivamente nel test di sensibilità agli antibiotici è la cosidetta MIC o minima concentrazione inibente (MCI o CIM ).La MIC è definita come la minima concentrazione in un range di diluizione di antibiotico che inibisce la crescita visibile batterica.Purtroppo il clinico non sa interpretare correttamente la MIC e chiede solo se il ceppo è Sensibile o Resistente.Pertanto molti test di laboratorio non misurano la famosa MIC ma una stima della MIC semiquantitativa.Questa stima meno accurata della MIC è data da 2 concentrazioni di antibiotico note come breakpoints che determinano le 3 categorie piu' conosciute dal clinico che sono S,I,R.La scelta di queste 2 concentrazioni è data dal NCCLS che usa criteri batteriologici, farmacocinetici e clinici.Questi criteri vengono aggiornati di anno in anno.La definizione di queste 3 categorie secondo il NCCLS è la seguente:

Sensibile S:la categoria sensibile significa che l'infezione causata dal   ceppo presuntivamente  responsabile di quella infezione, isolato dal materiale patologico e la cui importanza è valutata sia dal microbiologo che dal clinico, puo' essere trattata con quell'antibiotico al dosaggio usuale raccomandato e che troviamo nei foglietti illustrativi che accompagnano per legge il farmaco.

Intermedio I: La categoria Intermedia significa che la infezione causata dal   ceppo presuntivamente  responsabile di quella infezione, isolato dal materiale patologico e la cui importanza è valutata sia dal microbiologo che dal clinico,puo' essere trattata con quell'antibiotico a un dosaggio leggermente piu' alto di quello usuale.La categoria Intermedia implica che quell'antibiotico si puo' usare tranquillamente   in quei distretti dove è piu' concentrato che non nel sangue quali nell'urina o quando un alto dosaggio appunto puo' essere usato senza che si raggiungano livelli tossici .

Resistente,R:I ceppi resistenti sono quelli non inibiti dalle concentrazioni sistemiche dell'antibiotico ai dosaggi normali e anche a quelli piu' alti

I dati dell'antibiogramma dovrebbero essere analizzati in termini di MIC, quindi di differenze fra MIC e di livelli serici raggiungibili.Infatti 2 antibiotici di ugulae efficacia (cioè entrambi Sensibili)possono avere MIC e livelli sierici diversi:va scelto quello con MIC piu' bassa ma anche con livelli sierici migliori perchè cosi' è possibile somministrarlo a dosaggi piu' bassi ossia meno frequentemente) migliorando la compliance del paziente, ma anche il rapporto costo-effetto " Stephen G. Jenkins.

La resistenza agli antibiotici è dovuta o  a una mutazione genetica del gene che codifica per la proteina bersaglio dell'antibiotico che non viene trasmessa ad altri ceppi o alla mutazione genetica trasmessa a ceppi della stessa specie o di specie diverse.

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1)Produzione di enzimi che inattivano gli antibiotici  quali la penicillinasi e le beta lattamasi a spettro allargato.Perchè sono importanti queste beta lattamasi e la loro determinazione? Perchè gli antibiotici beta lattamici sono i meno tossici fra gli antibiotici.Sono i piu' flessibili in quanto a dosaggio,  se si pensa che la ceftazidime viene iniettata in corso di meningite anche a dosaggi di decine di grammi al giorno.

2) Modificazione del target dell'antibiotico  quale la modificazione della PBP penicillin binding protein nel caso degli Stafilococchi oxacillino resitenti o MRSA o Streptococcus pneumoniae resistente alla penicillina. Le PBP si trovano sulla membrana citoplasmatica  del batterio.Vi è una classe di PBP che se alterate impediscono la divisione del batterio. Pertanto i batteri si allungano ma non si dividono (per osmosi la cellula viene distrutta).Anche dosi sub inibenti di antibiotico,  come le ritroviamo all'esterno dell'alone di inibizione,  determinano allungamento dei batteri che si presentano come un filamento di batteri. I ceppi di Stafilococco meticillino resistenti presentano una proteina PB2 a(lterata) che presenta scarsa affinità intrinseca per gli antibiotici betalattamici.Quando uno stafilococco è meticillino resistente si eliminano tutti i betalattamici dalla terapia anche se dai test singoli risultano delle sensibilità .Si fa questo per andare cauti.La resistenza intrinseca è cromosomica,  mentre la iper produzione di penicillinasi è indotta da un plasmide.

3) Per modificazione delle porine (ponti proteici dentro la parete batterica)  gli streptococchi diventano resistenti all'ampicillina sulbactam.Le porine nei batteri gram negativi sono presenti dentro la membrana esterna.Questa è la causa della resistenza all'impinem dello Pseudomonas aeruginosa.

4) Meccanismo di efflusso :è l'espulsione della molecola con il trasporto attivo come nel caso dei Stafilococchi resistenti alle Tetracicline.

 

Il Vitek è un apparecchio automatico per l'identificazione e l'antibiogramma .Ha una temperatura nell'incubatore delle cards di 35 °C +- 0.4 e non a 37 °C perchè solo a 35°C si esprime la meticillino resistenza.L'incubazione deve essere prolungata per almeno 24 ore.Si classificano gli stafilococchi MR come resistenti anche alle cefalosporine.Un precedente screening dei ceppi su agar sale- oxacillina serve a evidenziare i ceppi MR da saggiare , dato che i sistemi automatici spesso non riescono a identificare i ceppi border-line.Questi ceppi si definiscono meticillino resistenti perchè la meticillina è stata la prima penicillina di sintesi , serviva per combattere negli anni 60 i primi ceppi penicillino resistenti , cioè produttori di penicillinasi.

Il MicroScan della Dade Behring è un apparecchio per l'identificazione e il test di sensibilità approvato dalla NCCLS in quanto ne segue strettamente le raccomandazioni.Il Vitek è stato approvato dalla NCCLS solo per l'identificazione, mentre è approvato per i test di sensibilità da altri organismi internazionali.Ulteriori informazioni sul nuovo Vitek2 nel sito citato sopra.

Difetti dei sistemi automatici per l'identificazione e i test di sensibilità:

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1) Non ci sono ancora test di sensibilità automatici  su batteri cosidetti fastidiosi quali lo S. pneumoniae.Solo il Vitek2 di recente introduzione automatizza l'antibiogramma per lo pneumococco per lo screening della resistenza alla penicillina.

2) I pannelli di antibiotici non comprendono i nuovi antibiotici .Dopo l'immissione in commercio ci vogliono almeno 6 mesi prima che siano introdotti nel Vitek o MicroScan.

3) gli antibiotici testati non sono spesso quelli adottati nei formulari dei vari Ospedali.

4) L'automazione non rileva spesso l'emergere di resistenze quali gli enterococchi vancomicina resistenti,  Staphylococcus aureus vancomicina intermedi VISA,  e i batteri gram negativi produttori di ESBL.

5) Non esiste ancora una vera automazione dei primi step , pertanto la preparazione dei ceppi da testare e identificare è ancora manuale.Solo il Vitek2 ha una certa automazione per i primi step.

6) Come detto,  prima della introduzione del Vitek2 , gli strumenti automatici non erano in grado di testare i microorganismi fastidiosi.Adesso il Vitek2 rileva la produzione di penicillinasi nello Streptococcus pneumoniae.

7)anche se i tempi di incubazione si sono ridotti, il tempo di lavoro manuale non si è ancora ridotto significativamente e inoltre dobbiamo ancora basarci su organismi cresciuti dal giorno prima,  prima di cominciare il test.

Il futuro sarà nelle sonde genetiche che permetteranno l'identificazione e la determinazione della sensibilità direttamente nel fluido biologico

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La MIC è diversa dalla MBC che è la minima attività battericida . Quando seminiamo da una provetta in piastra e non vi cresce niente allora ci troviamo di fronte a batteri uccisi.Quando la provetta è limpida i germi sono inibiti o sono morti? In genere la MBC è da 2 a 4 volte la MIC.Negli antibiotici glicopeptidi la MIC e la MBC coincidono.Le beta lattamine hanno il fenomeno inverso. Gli amminoglicosidi danno una sinergia con le beta lattamine. Inibiscono la sintesi proteica mentre le beta lattamine agiscono rendendo più permeabile agli amminoglicosidi il batterio stesso ..

 

WHAT IS AN MIC ANYWAY?

Editor’s Note: This article was copied from the Antimicrobic Therapy Guide written by John E. Swartzberg, M.D., F.A.C.P. Fourth Edition Published by Baxter Healthcare Corporation MicroScan Division)

The role of antimicrobic agents is to add to the host defenses and thus alter the diseased state. There are some key observations that should be deduced from this obvious point:

  1. Antimicrobics do not eliminate the infection, only the host can do this.
  2. The weaker (i.e. compromised) the host, the more critical becomes optimal antimicrobic therapy.

The technology for determining relative susceptibility is a microtechnique which measures the minimum amount of antimicrobic necessary to inhibit the growth of an organism (i.e., Minimum Inhibitory Concentration or MIC). Antimicrobial agents are serially diluted in small wells of a plastic tray, as shown below. The numbers below each well represent the amount of antimicrobic in that well (expressed in mcg/ml). Each antimicrobic dilution is simultaneously inoculated with a standardized amount of test organism, incubated 18 - 24 hours and observed for the presence of bacterial growth.

By relating the MIC to the amount of antimicrobic which may be achieved at the site(s) of infection, the physician can readily determine:

  1. Which antimicrobics, what specific dosages and what routes of administration may be used: Usually one should look for an achievable antimicrobic level of at least 2 - 4 times the MIC at the sites of infection. (Many investigators recommend that at least 10 times the Minimum Bactericidal Concentration (MBC) is desirable for central nervous system infections). In uncomplicated urinary tract infections (cystitis), urine rather than serum levels should be used. Using the example above, the oral form of ampicillin would be effective for an infection in the lower urinary tract because 350 mcg/ml is achieved in the urine and the MIC is only 4 mcg/ml, but this dosage would not be efficacious for blood or tissue infections where only 1 - 3 mcg/ml are achieved.
  2. Why should the achievable antimicrobic level be a minimum of 2 -4 times the MIC?
  • Because of the peaks and valleys in the fluctuation of serum antimicrobic levels, a high peak level should keep an "adequate" amount of drug in the serum throughout most of the dosing interval assuring the continuous inhibition of bacterial growth.
  • Although we measure serum levels, the amount of antimicrobic in the infected tissue is what is likely to be critical in most infections. Since the tissue level is usually somewhat less than the serum level, by obtaining a high serum to MIC ration the probability of achieving an adequate tissue level is enhanced.
  1. Which of several "susceptible" antimicrobics will be the most active: A Drug which has an achievable level of 20 times the MIC should be more active than a drug with and achievable level of only 2 times the MIC if other pharmacological properties are similar. When choosing between several closely related drugs, such as gentamicin and tobramycin, MIC data may show the test organism to be significantly more susceptible to one than the other(s).
  2. What is an MBC: The minimum amount of antimicrobic required to kill an organism is called the minimum bactericidal concentration or MBC. Usually the MIC and MBC are within 1 to 2 dilutions of each other. Because of this, the MIC is usually used clinically as results are available 24 hours earlier. Occasionally an organism may have an appreciably higher MBC than MIC. This suggests the organism is "tolerant" to the antimicrobic and may have therapeutic implications.

Il 98% degli stafilococchi sono penicillinasi produttori mentre quando si parla di meticillino resistenza non si intende che il batterio è semplicemente resistente alla meticillina,  ma che questa resistenza nasconde una più generale resistenza a svariati antibiotici: è un epifenomeno di una multiresistenza.Gli stafilococchi meticillino resitenti o SMR hanno la PBP 2 modificata come PBP 2a come si vede con la isoelettrofocusing.La PBP non è più un bersaglio. Sono inoltre resistenti al tazobactam, all'acido clavulanico e a antibiotici non betalattamine. Per indagare la condizione degli stafilococchi studiamo quelli isolati dal naso. All'interno di una stessa colonia si è visto che 1 batterio su 10^8 ha una multiresitenza.Questo batterio sostituirà i ceppi sensibili.Per scoprire gli stafilococchi meticillino resistenti si usa il dischetto di oxacillina più stabile di quello della meticillina.Il terreno Muller Hinton deve essere al 2% di NaCL, la temperatura di incubazione a 35°C e non 37°C. Questi ceppi crescono altrimenti più lentamente.

Con l'E test , striscia della oxacillina,   si evidenziano due aloni di inibizione a vari tempi. Se la MIC è superiore a 16 gamma il ceppo è MR questo significa che è resistente anche all'imipenem, al muropenem , alle ureidopenicilline,  ai macrolidi! L'evidenziazione della betalattamasi esclude antibiotici quali la piperacillina, l'amoxicillina,l'ampicillina ecc. Con l'E test si possono testare antibiotici in coppia quali: glicopeptidi+amminoglicosidi,   glicopeptidi+rifampicina , trimetroprim+sulfamessazolo in diverso rapporto ,acido fusidico+rifampicina, chinolonici+rifampicina.

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L'E test o epsilon test dalla forma dell'alone di inibizione, è un metodo quantitativo che determina la MIC.Una striscia di plastica impregnata da un gradiente calibrato di antibiotico è posto su una piastra dove è stato posto un inoculo standard del batterio isolato.La MIC è facilmente letta lunga la striscia laddove le colonie intersecano la striscia.In questa immagine , le colonie attraversano la striscia  a un valore di 0,94 mcg/ml..

 

Spesso un batterio sensibile al bactrim (=trimet.+sulfametossazolo) è resistente in vivo perchè assume l'acido folico dai tessuti circostanti! La resistenza a determinati antibiotici funge da marker per identificare i  batteri: La resistenza alla clindamicina è un marker di enterococchi, come le cefalosporine di 2 e 3 generazione.Gli amminoglicosidi agiscono sul ribosoma ossigeno dipendente ma gli streptococchi sono omofermentanti e fanno a meno dell'ossigeno.Saggiamo per gli enterococchi l'ampicillina, i chinolonici e l'imipenem. Anche se c'è in vitro un minimo di sensibilità per gli amminoglicosidi,  dato che danno sinergia con le betalattamine,  vale la pena provarli sugli enterococchi.Si usa allora il dischetto da 1 grammo di gentamicina. Gli enterococchi sono fra i batteri più studiati per la resistenza.Le curve di killing sono particolari soprattutto in E. fecium.La teicoplanina è superiore alla vancomicina che è più diffusa in USA perchè prodotta da una multinazionale americana la Lilly. L'8% dei ceppi di Enterococcus sono resistenti alla vancomicina in USA.Le ureidopenicilline vanno bene per gli enterococchi che hanno rari ceppi beta lattamasi produttori.

L'azitromicina per gli streptococchi è controversa.Se ne dà 500 mg/giorno/per 3 giorni e perdura per 15 giorni. Ma dà effetti collaterali e recidive inspiegabili.Per i bambini la dose è 10 mg/kg di peso/die.E' attendibile il Muller Hinton per gli streptococchi che hanno tempi di crescita lenti?

Possono i meccanismi di resistenza dimostrati, cioè "visti" in vitro?Questo avviene solo per alcuni meccanismi biochimici di resistenza quali il rilevamento delle beta lattamasi con il metodo dell'idrolisi del nitrocefin.L'antibiogramma puo' solo far sospettare la presenza di un meccanismo di resistenza.

Problema delle betalattamasi a spettro allargato o EBS beta lattamasi. Sono lattamasi che determinano resistenza contemporaneamente a ceftazidime/cefotaxime/aztreonam.Si evidenziano ponendo a una certa distanza dal dischetto di betalattamico un dischetto di acido clavulanico.Diciamo che su una piastra di Muller Hinton si mette un dischetto di cefalosporina di 3a generazione e  aztreonam e a 3 cm un disco di una pencillina + inibitore di betalattamasi (amoxicillina+ acido clavulanico). Dobbiamo il giorno dopo osservare se l'alone di inibizione aumenta nella regione fra i 2 dischetti, formando una specie di ribosoma , si puo' usare anche l'E test con 2 strisce una di ceftazidime e l'altra di ceftazidime + clavulanato. se l'alone di inibizione aumenta nella zona di contatto con l'acido clavulanico,  ci troviamo di fronte a un ceppo betalattamasi a spettro esteso.I batteri produttori di beta lattamasi a largo spettro possiedono dei plasmidi multiresistenti che si possono trasferire facilmente fra i membri della famiglia enterobatteriacea, nello stesso paziente.Alla lunga gli enterobatteri diventano tutti resistenti a una grande varietà di antibiotici quali le cefalosporine e le beta lattamine.Sarebbe interessante uno screening dei pazienti ricoverati per cercare nelle feci la prevalenza dei ceppi di enterobatteri produttori di betalattamasi a spettro esteso prima e dopo di intraprendere una qualche terapia antibiotica ad ampio spettro.Le beta lattamasi ad ampio spettro ESB si evidenziano sulle piastre MH dall'effetto a tappo di champagne evidente in aztreonam e cefalosporine di 3 generazione quando testate assieme all'acido clavulanico.Cercare le beta lattamasi ES in E. Coli, Klebsiella,Enterobacter.Purtroppo il clavulanato è sotto brevetto e non viene associato alle cefalosporine che sono antibiotici induttori di beta lattamasi (cefalosporine betalattamasi inducibili bli )

Spesso nell'antibiogramma testiamo antibiotici che non hanno alcuna importanza terapeutica come l'oxacillina.L'oxacillina è un marker di resistenza nel caso degli stafilococchi.La resistenza alla oxacillina prefigura una resistenza piu' estesa ad alcune classi di antibiotici quali le penicilline , chinoloni, aminoglicosidi e i macrolidi.Nel caso dello S.pneumoniae la resistenza alla oxacillina fa sospettare una resistenza alla penicillina che va verificata con il metodo della MIC in brodo arricchito.La resistenza alla penicillina G è allargata a tutti i beta lattamici anche se con vari livelli di resistenza che solo possono essere dati dalla valutazione della famosa MIC per il cefotaxime, l'ampicillina.

 

Si definiscono ceppi di Stafilococco aureo meticillino-resistenti quei ceppi che resistenti alla penicillina , lo furono anche alla meticillina,  la prima penicillina semisintetica resistente alla penicillinasi.Il fenomeno della meticillino resitenza arrivò solo negli anni 70 in USA.Oggi gli SAMR o MRSA  sono la principale causa di infezione ospedaliera.I ceppi MR presentano una proteina penicillino-legante diversa dalla PBP 2 detta PBP 2a che presenta scarsa affinità a tutti gli antibiotici beta lattamici.Per evidenziare i ceppi MR da bassa espressivitià della proteina PBP 2 a (lterata) si deve fare un inoculo più denso, incubazione a 35 °C ,prolungata, modifica al Muller Hinton.Anche se i singoli test per gli antibiotici beta lattamici sono variabili,  è meglio essere cauti e definire resistenti tutti i ceppi indipendentemente dai singoli test.La super produzione di penicillinasi è l'altro meccanismo di resistenza agli antibiotici beta lattamici.Questa resistenza è mediata da un plasmide e contrastata dall'acido clavulanico.Benchè le penicilline semisintetiche siano state realizzate per resistere all'idrolisi della penicillinasi , l'iperproduzione di penicilinnasi induce una certa inattivazione delle penicilline semisintetiche.

 

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- La tecnica della diluizione in brodo determina accuratamente la MIC .Si parte da un inoculo batterico di 100,000 organismi/ml in brodo nutritivo che vengono posti in una serie di provette o pozzetti che contengono diverse concentrazioni di antibiotico.

-Dopo incubazione di 18-24 ore otteniamo dei risultati che devono essere interpretati.

- minima concentrazione inibente  (MIC) è  3.1 ug/ml 

- minima concentrazione battericida (MBC) è 6.2 ug/ml

- E' un dato che indica l'uso clinico dell'antibiotico? Per saperlo dobbiamo porci questa domanda:l'antibiotico in questione raggiunge nel sangue almeno la concentrazione di 3,1 gamma per un certo tempo cosi' che il batterio sarà inibito in quel distretto (il sangue) ?

- Ricordiamo che la MIC in quanto indica una inibizione della crescita non indica che il batterio a quella concentrazione venga ucciso ( sebbene in pratica una lunga inibizone della crescita conduca alla eliminazione del batterio attraverso le difese immunitarie nell'ospite normale).

- MBC è normalmente superiore alla MIC .Dato che comporta la semina del brodo su agar , il test ha delle limitazioni per il tempo che si perde e i costi.E' richiesto per il trattamento di affezioni molto difficili da eradicare quali l'endocardite e l'osteomielite.

- Anche in questi test ci puo' essere un errore di misura .Essi sono accurati a +- una diluizione scalare.Pertanto la MIC dell'esempio  puo' essere in un range di 1,5-6,2 gamma.

il metodo di Kirby Bauer o della diffusione dai dischetti , parte da una certa densità di inoculo che viene piastrato su agar Mueller-Hinton.La standardizzazione evita gli errori di inaccuratezza :un inoculo ad alta densità di partenza corrisponde ad aloni di inibizione più piccoli e quindi a false resistenze.L'inoculo andrebbe sospeso in brodo Muller-Hinton a una densità di 0,5 MC Farland.La piastra va prima posta a temperatura ambiente e dopo fatto lo spatolamento si lascia asciugare l'inoculo.I dischetti hanno un diametro standard di 6 mm.La distanza dal bordo della piastra deve essere di almeno 15 mm, mentre la distanza tra i dischetti deve essere di 20 mm.Si incuba a 35° C.Le piastre vanno rovesciate a evitare la condensa.Spesso si notano colonie isolate all'interno dell'alone di inibizione.Possono essere o mutanti resistenti o colonie estranee dovute a coltura mista.Una piastra incubata in CO2 fa diminuire l'attività dei macrolidi e degli aminoglicosidi, mentre fa aumentare l'attività dei beta lattamici e delle tetracicline.Gli aloni di inibizione correlano approssimativamente con le MIC.Diametri di inibizone superiore a un certo valore indicano sensibilità , diametri inferiori resistenza e fra questi due valori si definisce il ceppo a sensibilità intermedia.

Sia nel test di Kirby Bauer che nelle diluizioni in brodo di apparecchi automatici   si usano 2 valori limite o di cut off detti break-points che sono stabiliti dalla NCCLS.Nel primo caso saranno dei diameteri.In genere si saggiano centinaia di ceppi batterici e si calcola la MIC 90 , cioè la MIC che inibisce la crescita del 90% dei ceppi e questo valore è il breakpoint 2 .La MIC 60% stabilisce grosso modo il break point piu' basso.Quando il ceppo è inibito al BP piu' basso è Sensibile, se è inibito solo al BP piu' alto è Intermedio, se è inibito alle 2 concentrazioni è Resistente. La diffusione del farmaco è emisferica nel dischetto del metodo KB.Il dischetto assorbe l'acqua dell'agar e contempraneamente inizia la duplicazione dei batteri.Vi possono esserci ceppi dove la duplicazione è più rapida della diffusione o più lenti.Il metodo delle 2 concentrazioni di farmaco o saggio di sensibilità al break point è utilizzato per esempio nel metodo delle proporzioni dei micobatteri o per saggiare la sensibilità dei micoplasmi e anche negli apparecchi automatici quali il MicroScan dove esistono pannelli di antibiotici secondo le MIC o i breakpoints.I pannelli secondo i breakpoints hanno il vantaggio di poter saggiare un numero piu'  elevato di antibiotici.

Per lo screening della meticillino resitenza con il KB negli stafilococchi,  si usano i dischetti di oxacillina al posto della meticillina perchè piu' stabile.Il fenomeno della meticillina resitenza è dovuto a un trasposone che si collega al cromosoma.Vi sono canali porinici per i betalattamici che sono  idrofili nello strato esterno lipopolisaccaridico dei  gram negativi.L'imipenem è una molecola piccola, passa più rapidamente.Le betalattamasi e le porine competono per il legame con i beta lattamici. Enterobacter ha una resistenza alta alle cefalosporine di 3a generazione. Sensibilità di Ps aeruginosa: 75% S all'amikacina 50% S alla gentamicina 80% S all'imipenem.  

Anche il siero del paziente che sta assumendo antibiotici può essere saggiato.Il sangue è prelevato al picco dell'antibiotico utilizzato, quindi il siero è diluito in brodo e testato contro l'isolato microbico.Questo test è raramente effettuato e solo per i casi di endocardite , osteomielite o sepsi nel paziente immunocompromesso. Il ceppo isolato viene conservato e si cimenta con il siero diluito.Si registrano le provette limpide che si seminano su piastra. Si vede se c'è stato killing o solo inibizione

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